针对多重耐药肺炎克雷伯菌（MDR Klebsiella pneumoniae）外膜蛋白OmpK35和OmpK36的植物化学物质的计算机模拟（In-Silico）和体外评估（In-Vitro）

《Nano Trends》：In-Silico and In-Vitro Evaluation of Phytochemicals Targeting Outer Membrane Proteins OmpK35 and OmpK36 of MDR Klebsiella pneumonia

本研究通过计算模拟与实验验证，发现N-姜黄素和Myricetin能有效抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的外膜孔蛋白OmpK35和OmpK36，降低MIC和MBC至7.5 mg/mL，抑制生物膜形成达40-48%，并显著减少细菌代谢活性（OCR降低0.35-0.64倍）。这些化合物通过氢键网络稳定结合孔蛋白，阻碍抗生素渗透，兼具抗生物膜和代谢抑制双重作用，为新型抗菌剂开发提供依据。

　　多药耐药性（MDR）的肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*）已成为全球公共卫生领域的一大挑战。这类细菌因其对多种抗生素的耐受性以及增强的致病能力，给临床治疗带来了极大的困难。尤其值得注意的是，肺炎克雷伯菌常携带碳青霉烯酶编码基因，使其对包括碳青霉烯类在内的关键抗生素产生耐药性。这种耐药性的出现不仅威胁到现有的抗菌治疗策略，也凸显了开发新型抗菌药物的紧迫性。世界卫生组织（WHO）已将碳青霉烯耐药性肺炎克雷伯菌列为最需优先研究的病原体之一，强调了在“ESKAPE”（Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter spp.）病原体中寻找新的抗菌策略的重要性。

肺炎克雷伯菌的外膜蛋白，尤其是OmpK35和OmpK36，被认为是其耐药性和致病性的重要介质。这些外膜孔蛋白在细菌的外膜中起着关键作用，它们不仅调控小分子的跨膜运输，还影响细菌对某些抗生素的渗透性。通过抑制或下调这些孔蛋白的功能，细菌能够显著减少药物进入细胞的能力，从而增强其对β-内酰胺类抗生素和碳青霉烯类药物的抵抗力。因此，针对这些孔蛋白的药物开发具有重要的临床意义，不仅可以直接削弱细菌的生存能力，还可能提高现有抗生素的疗效。

本研究旨在通过整合的计算机模拟与实验验证方法，筛选并评估能够靶向OmpK35和OmpK36的植物来源化合物。该研究首先利用分子对接技术对超过100种植物化合物进行了初步筛选，其中N-姜黄素（N-curcumin）和没食子酸（myricetin）表现出最强的结合亲和力。N-curcumin对OmpK35的结合自由能为-7.33 kcal/mol，而对OmpK36的结合自由能为-7.58 kcal/mol。相比之下，标准抗生素庆大霉素（gentamicin）的结合自由能分别为-5.33 kcal/mol和-5.51 kcal/mol。这表明N-curcumin和myricetin在结合这两种外膜孔蛋白方面具有更强的潜力。

为了进一步验证这些化合物的药理特性，研究团队对其进行了吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测分析。结果显示，N-curcumin和myricetin在胃肠道吸收、代谢稳定性和毒性风险方面均表现出良好的特性。相比之下，strychnine虽然在结合亲和力方面表现尚可，但其潜在的毒性问题限制了其临床应用的可行性。ADMET分析为后续的实验验证和临床研究提供了重要的理论依据，确保了所选化合物的安全性和有效性。

为了评估这些化合物在实际应用中的稳定性，研究团队进行了分子动力学（MD）模拟。MD模拟不仅能够分析蛋白质-配体复合物的构象变化，还能揭示动态环境下的结合行为。结果显示，N-curcumin和myricetin在与OmpK35结合时表现出更高的结构稳定性，这与其较低的RMSD值和有利的RMSF值相一致。此外，Rg（半径为质心）分析也支持了这些化合物在与OmpK35形成复合物时的结构紧凑性。这些结果进一步验证了N-curcumin和myricetin作为潜在抗菌药物的可行性，并表明OmpK35可能是这些植物来源化合物的更优靶点。

在实验验证阶段，研究团队通过微量稀释法评估了这些化合物的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示，N-curcumin和myricetin在7.5 mg/mL浓度下均能有效抑制细菌生长，并达到较高的杀菌效果。此外，这些化合物在抑制细菌附着和生物膜形成方面也表现出显著的活性。在生物膜抑制实验中，N-curcumin和myricetin的抑制率分别达到了40-48%和32-40%，与庆大霉素的抑制效果相当。通过结晶紫染色和显微镜观察，研究团队进一步确认了这些化合物对生物膜的破坏作用，显示出其在抗生物膜方面的潜力。

为了全面评估这些植物来源化合物的抗菌活性，研究团队还进行了氧消耗率（OCR）实验，以检测其对细菌代谢活动的影响。OCR实验结果显示，这些化合物显著降低了肺炎克雷伯菌的氧消耗率，表明它们能够干扰细菌的呼吸代谢过程。对于MTCC-432菌株，myricetin的OCR降低幅度为0.40-0.52倍，而N-curcumin的降低幅度为0.35-0.47倍。这一结果不仅支持了这些化合物在抗菌方面的有效性，还进一步表明它们在削弱细菌代谢能力方面具有显著的潜力，这为它们作为抗耐药性病原体的新型治疗手段提供了坚实的实验基础。

本研究的综合结果表明，N-curcumin和myricetin不仅在抑制细菌生长和杀菌方面表现出色，还在破坏生物膜和抑制细菌代谢活动方面具有显著效果。这些发现为开发新的抗菌策略提供了重要的线索，尤其是在应对多药耐药性肺炎克雷伯菌的挑战方面。此外，这些植物来源化合物的抗生物膜特性也为减少医疗设备相关感染提供了新的思路，例如开发具有抗菌性能的生物膜抑制涂层。

研究团队强调，植物来源化合物因其结构多样性和多靶点作用机制，具有成为新型抗菌药物的巨大潜力。与传统抗生素相比，这些化合物不仅能够直接针对细菌的耐药机制，还可能通过干扰其致病性因子来实现更全面的抗菌效果。此外，它们的低毒性和良好的药代动力学特性使其在临床应用中更具优势。

本研究的成果表明，结合计算机模拟与实验验证的方法可以有效筛选出具有抗菌潜力的植物来源化合物。N-curcumin和myricetin的优异表现不仅为对抗多药耐药性肺炎克雷伯菌提供了新的候选药物，还为未来的药物开发和临床研究指明了方向。未来的研究应进一步探讨这些化合物的作用机制，并评估其在实际临床环境中的应用潜力。

综上所述，本研究通过系统性的筛选和验证，揭示了N-curcumin和myricetin在对抗多药耐药性肺炎克雷伯菌方面的潜力。这些化合物能够有效抑制细菌的生长、破坏其生物膜结构，并干扰其代谢活动，为开发新的抗菌药物提供了重要的理论和实验依据。此外，它们的低毒性和良好的药代动力学特性使其在临床应用中具有较大的前景。随着抗生素耐药性问题的日益严峻，植物来源化合物作为替代治疗手段的价值愈发凸显，值得进一步深入研究和开发。