基于百里香精油制成的纳米杀菌剂，用于防治罗克斯堡天南星（Anoectochilus roxburghii）的镰刀菌枯萎病

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Thyme essential oil-based nano-fungicide for managing fusarium wilt in Anoectochilus roxburghii

开发TEO@AMSNs纳米生物杀菌剂，体外抑制镰刀菌93.23%（3.84 mg/mL），优于游离TEO（67.77%）。机制为膜破坏及ROS积累，DFT证实氢键驱动稳定释放。体内试验于Anoectochilus roxburghii中，显著减轻症状，促进根发育，叶绿体及多糖水平保持，减少氧化应激，为可持续土传病害防治提供新策略。

　　这项研究开发了一种基于百里香精油（TEO）的生物杀菌剂，将其封装在氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒（AMSNs）中，并对其杀菌效果进行了评估。在体外实验中，TEO@AMSNs制剂在3.84毫克/毫升浓度下表现出93.23%的菌丝生长抑制率，显著优于未封装的TEO（仅67.77%的抑制率），并且具有13.44%的载药率。机制研究表明，这种效果源于持续且强烈的细胞膜破坏以及真菌细胞中活性氧（ROS）的过量积累。密度泛函理论（DFT）计算进一步确认，这种稳定的释放特性是由AMSNs载体与精油之间的氢键相互作用所驱动的。在体内试验中，针对易受尖孢镰刀菌（F. oxysporum）感染的药用植物“金线莲”（A. roxburghii），结果表明TEO@AMSNs显著减轻了病害症状，并促进了根系发育。接种的植物在使用2 MIC的TEO@AMSNs处理后，侧根数量接近正常水平（约42），而未处理的对照组仅有23。显微分析显示，处理后的植物具有完整的叶绿体和保留的多糖水平，表明氧化应激和代谢紊乱被有效缓解。此外，黄酮类物质的积累也得到了增强，进一步支持了该制剂在减轻病原体诱导应激方面的功能。这些发现突显了TEO@AMSNs作为管理镰刀菌感染和增强作物抗性的有前景、可持续的生物杀菌剂的潜力。

研究表明，镰刀菌（F. oxysporum）是一种土壤传播的丝状植物病原体，对全球农业构成重大威胁，导致多种宿主植物出现根腐、萎蔫和坏死等病害（Gordon, 2017；Edel-Hermann and Lecomte, 2019）。这种病原体影响超过150种作物，包括谷物（小麦、大麦、玉米）、豆类（豌豆、豆）、坚果（杏仁、核桃）、蔬菜（洋葱、土豆、黄瓜）、水果（柑橘类、热带水果、苹果）以及香料（辣椒、胡椒）。它被列为十大最重要的植物病原体之一，对作物产量和植物健康造成严重影响。传统的应对策略主要依赖于合成化学杀菌剂，但这些化学物质的连续使用导致了严重的环境问题，包括土壤和水体污染，以及真菌抗性的快速产生。此外，气候变化带来的挑战——增加植物应激并可能改变土壤传播病原体的分布和致病性——强调了开发新型、可持续和有效的作物保护策略的紧迫性，以确保全球粮食安全。

精油（EOs）是从芳香植物中提取的天然挥发性化合物，具有强大的抗菌、抗炎和抗氧化活性，因此成为生物农药的有潜力候选者（Yang et al., 2025）。然而，它们固有的挥发性和易降解性导致了实际应用中的诸多挑战。开发高效的纳米递送系统以提高精油的使用效果是当前研究的重点，主要目标是保持其有益特性（Lammari et al., 2020），增强稳定性，并实现可控释放。纳米载体，如聚合物纳米颗粒、多糖、蛋白质（Jobdeedamrong et al., 2018）以及多孔材料（Su et al., 2024），已被证明在改善精油的稳定性、释放和生物利用度方面具有潜力。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）因其独特的结构特性，成为精油封装的特别有吸引力的平台（Weisany et al., 2024）。MSNs是一类具有明确孔结构的二氧化硅纳米材料，孔径范围从2到50纳米。这些多孔结构，结合其高比表面积、易于功能化、良好的机械稳定性和生物相容性，推动了MSNs在精油微胶囊化方面的研究，以增强其抗菌活性。MSNs已被用于封装茶树油（Gao et al., 2020a；Gao et al., 2020b；Chen et al., 2021；Qiu et al., 2021；Zhong et al., 2021）、肉桂精油（Gulin-Sarfraz et al., 2022）、香茅和丁香精油（Sattary et al., 2020）、牛至精油（Sullivan et al., 2021）、丁香精油（Singh et al., 2023）、 Eugenol 和 Thymol（Ribes et al., 2017）以及其他精油，以实现持续释放和增强效果。

百里香精油（TEO）是从百里香（Thymus vulgaris）这种草本植物中提取的，因其多样的治疗特性而具有悠久的药用历史。现代研究越来越关注其作为天然广谱抗菌剂的潜力（Abdollahzadeh et al., 2014）。TEO中的关键生物活性成分——百里香酚（thymol）——主要负责其抗菌和抗真菌活性。最近的研究表明，将百里香酚封装在MSNs中可以显著增强其抗菌效果。例如，Shahriarinour 等人发现，将百里香酚封装在氨基功能化的SBA-15介孔二氧化硅纳米颗粒（SBA-15-NH?）中，能够将对抗金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的最小抑菌浓度（MIC）降低50%（从1.0降至0.5毫克/毫升），突显了其抗菌活性的明显增强（Shahriarinour et al., 2019）。同样，Liu 等人观察到，将百里香酚衍生物固定在二氧化硅纳米颗粒上，能够将对抗大肠杆菌（Escherichia coli）的最小杀菌浓度（MBC）降低约30%（Liu et al., 2022）。此外，将百里香酚封装在MSNs中在食品保鲜应用中也显示出提高抗真菌活性的潜力（Cui et al., 2023）。

氨基功能化的MSNs（AMSNs）因其增强的吸附能力和可控释放特性而成为有前景的纳米载体（Szegedi et al., 2011）。Tao 等人探索了AMSNs用于通过静电相互作用吸附带负电荷的DNA的应用（Tao et al., 2014）。Jangra 等人研究了氨基修饰的SBA-15对Emodin的可控释放，观察到与未修饰的SBA-15相比，释放速率更慢（Jangra et al., 2016）。Szewczyk 等人进一步展示了氨基修饰的SBA-15对Cefazolin的吸附能力显著提高，并伴随延长的释放曲线（Szewczyk and Prokopowicz, 2018）。此外，He 等人报告称，通过改变氨基基团的密度，可以调节DOX（多柔比星盐酸盐）在AMSNs上的载药能力（He et al., 2017）。尽管这些研究突显了AMSNs在药物输送中的多功能性，但将其用于封装和释放TEO作为对抗植物病原体的高效杀菌剂仍是一个未被充分探索的领域。

在本研究中，开发了封装有TEO的AMSNs作为新型杀菌递送系统，用于对抗在A. roxburghii中感染的F. oxysporum。AMSNs通过一种简便的一锅法合成，并随后装载TEO以形成TEO@AMSNs。该设计采用了表面胺（?NH?）基团，提供了两个关键优势：（1）增强载药量：胺基团被设计成与百里香酚的酚羟基形成强氢键或弱静电相互作用，从而比非功能化的载体具有更高的载药能力。（2）持续释放：这些表面相互作用确保了优化的TEO释放曲线，对于长期对抗土壤传播病原体的杀菌作用至关重要。

该系统旨在提高TEO的稳定性、载药量和可控释放能力，从而增强其对抗F. oxysporum的杀菌效果。AMSNs的载药效率与传统MSNs进行了系统比较，同时利用DFT计算阐明了TEO与AMSNs之间的相互作用机制。DFT是一种基于第一性原理的量子力学计算方法，能够预测分子的电子结构和结合能，为研究纳米尺度系统中的稳定性和相互作用机制提供了强大的工具。TEO@AMSNs的杀菌性能不仅在体外实验中进行了评估，还在体内实验中使用A. roxburghii模型进行了评估，考察了关键参数，如真菌抑制、植物生长和根系发育。TEO@AMSNs的成功展示代表了在可持续和环保的作物保护方面的重要进展，提供了一个可扩展的纳米载体平台，以对抗土壤传播病原体并促进特种作物的安全。

在材料和试剂部分，本研究使用了多种化学试剂，包括十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%）、四乙基正硅酸酯（TEOS，98%）、盐酸（HCl 36%）、乙醇（99.9%）以及3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES，98%），这些试剂均从不同的供应商处获得。此外，还使用了氨水（99.9%）和乙酸乙酯（99.9%）等试剂，用于后续的实验步骤。实验中使用的百里香油（TEO）纯度为99%，在实验过程中起到了关键作用。

在对AMSNs和TEO@AMSNs的表征部分，扫描电子显微镜（SEM）图像（图1A）显示，AMSNs呈现出球形形态，平均粒径为228 ± 47纳米。透射电子显微镜（TEM）图像（图1B）进一步提供了AMSNs内部结构的高分辨率可视化。在光对比的球形颗粒中，存在明显的暗对比孔道，证实了介孔结构的成功形成。小角X射线衍射（XRD）被用于表征AMSNs和TEO@AMSNs的结构，其在2θ范围为0.5°至5°（图1）。这些表征结果为后续的实验提供了重要的结构信息，确保了AMSNs和TEO@AMSNs的物理特性符合预期。

在结论部分，本研究证明了AMSNs作为高效和可持续递送系统在输送疏水性生物活性物质方面的潜力，如TEO。TEO@AMSNs制剂表现出比自由TEO或裸露AMSNs更强的抗菌活性，这是由于TEO与AMSNs之间的协同作用。AMSNs的介孔结构有助于抗菌剂的可控和持续释放，从而提高其效果，同时减少对环境的影响。此外，TEO@AMSNs还表现出对植物生长和根系发育的积极影响，这表明其不仅具有杀菌功能，还能够促进植物的健康。这些发现为未来开发基于纳米技术的生物农药提供了新的思路，也为作物保护和粮食安全提供了可行的解决方案。

在作者贡献声明中，Xia Liu主要负责监督和概念设计，Wanxin Huang负责调查和数据整理，Zifeng Zhu和Liyuan Yu共同参与了方法设计和调查工作，Yiru Chen、Yihui Bai和Xuexiang Weng负责数据整理和资金获取，Yongming Ruan负责撰写和修改论文，并提供监督。这些贡献体现了团队在不同研究环节中的分工合作，确保了研究的顺利进行和成果的实现。

在未引用的参考文献中，Liu et al., 2021；Ruiz-Rico et al., 2017；Yu et al., 2025等文献虽然未在正文中直接引用，但它们可能为本研究提供了重要的背景信息或相关研究的支撑。这些文献的研究内容涉及纳米技术在药物输送中的应用，以及精油作为抗菌剂的潜力，为本研究提供了理论和实践上的参考。

在利益冲突声明中，本研究未发现任何利益冲突，这表明研究的客观性和公正性。研究团队在实验设计和数据解读过程中保持了独立性，确保了研究结果的可信度和科学性。

在致谢部分，本研究得到了浙江省自然科学基金的资助（编号：LY18B050004），这为实验材料的采购、设备的使用以及研究的推进提供了必要的支持。该基金的资助有助于推动绿色农业技术的发展，为解决土壤传播病原体问题提供了资金保障。

综上所述，这项研究通过将TEO封装在AMSNs中，开发了一种新型、可持续的生物杀菌剂，用于对抗F. oxysporum在A. roxburghii中的感染。实验结果表明，该制剂在体外和体内均表现出优异的杀菌效果，并且能够促进植物的健康发育。这些成果不仅为植物病害的防治提供了新的方法，也为农业可持续发展和食品安全做出了贡献。未来的研究可以进一步优化AMSNs的结构和功能，提高其载药能力和释放效率，以拓展其在更多作物和病原体中的应用。同时，可以探索其在其他农业领域的潜力，如土壤改良、植物生长促进等，以实现更广泛的应用价值。此外，该研究还强调了跨学科合作的重要性，结合了化学、生物学和材料科学等多个领域的知识，为解决复杂的农业问题提供了新的思路。通过持续的研究和创新，有望开发出更多高效、环保的生物农药，为全球农业的可持续发展提供有力支持。