内皮Lon蛋白酶1通过作用于超氧化物歧化酶2的泛素化过程，有助于维持氧化还原平衡，从而预防肾小球硬化

《Redox Biology》：Endothelial Lon protease 1 facilitates the redox balance to prevent glomerulosclerosis by acting on superoxide dismutase 2 ubiquitination

内皮细胞LONP1通过稳定SOD2抑制氧化应激保护肾脏免受慢性肾病（CKD）损伤。敲除LONP1加剧5/6肾切除模型肾小球硬化、高血压、蛋白尿及炎症，机制涉及SOD2泛素化降解增加和mtROS积累。补充MnTBAP（SOD2模拟剂）或过表达SOD2可逆转上述病理变化。研究首次揭示LONP1-SOD2相互作用轴在CKD中的保护作用，为靶向治疗提供新思路。

　　在慢性肾病（CKD）的病理进程中，内皮细胞的损伤是早期的关键事件，它不仅导致肾血流动力学紊乱，还可能进一步引发肾小球硬化。这种内皮细胞损伤往往伴随着氧化应激和炎症反应，它们通过旁分泌机制启动了病理性细胞间相互作用。近年来，越来越多的研究表明，线粒体功能障碍在内皮细胞功能异常中扮演着核心角色。Lon蛋白酶1（LONP1）作为一种重要的线粒体蛋白酶，其功能主要在于维持线粒体的稳态，包括降解错误折叠和氧化修饰的蛋白质，发挥分子伴侣的作用，并与线粒体DNA（mtDNA）结合。尽管LONP1在多种组织和器官中广泛表达，且与多种疾病密切相关，但其在CKD中的具体作用机制仍不明确。

在本研究中，我们发现CKD患者的肾小球内皮细胞中LONP1表达水平显著下降，而在5/6肾切除（5/6Nx）小鼠模型中也观察到类似现象。进一步的实验表明，内皮细胞特异性异源基因敲除（hetero cKO）小鼠在5/6Nx模型中表现出更严重的肾小球硬化和肾功能恶化，包括蛋白尿、高血压以及肾小球炎症反应的加剧。这提示我们，LONP1可能在维持内皮细胞功能方面发挥着关键作用。

从机制上来看，我们的研究结果表明，LONP1的缺失显著增加了线粒体中活性氧（ROS）的水平，这是通过促进线粒体超氧化物歧化酶2（SOD2）的泛素化实现的。SOD2是唯一存在于线粒体中的超氧化物歧化酶，它在清除自由基、防止氧化应激相关疾病方面具有重要作用。LONP1通过与SOD2相互作用，稳定其表达，从而降低ROS的异常释放。这一发现为理解LONP1在维持线粒体氧化还原平衡中的作用提供了新的视角，也揭示了其在肾小球硬化的发病机制中的潜在角色。

为了进一步验证这一假设，我们采用了多种实验方法，包括免疫荧光（IF）、免疫组织化学（IHC）、透射电镜（TEM）以及分子生物学技术如Western blot、实时定量PCR（qRT-PCR）等。在细胞水平上，我们观察到LONP1的沉默显著增加了MAECs和HAECs中总ROS和线粒体ROS（mtROS）的水平，而LONP1的过表达则能够有效抑制这些变化。此外，我们还通过体外实验发现，LONP1的沉默导致了多种炎症相关蛋白的表达增加，包括CD31、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞间粘附分子1（ICAM-1），这些蛋白的增加与内皮细胞功能受损和炎症反应加剧密切相关。

在动物模型中，我们利用5/6Nx模型评估了LONP1对肾小球硬化的保护作用。结果显示，hetero cKO小鼠在5/6Nx处理后，其肾功能指标如血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平显著上升，尿蛋白含量也明显增加。通过Masson三色染色和PAS染色，我们发现这些小鼠的肾小球基底膜（GBM）增厚、系膜细胞和基质增生以及胶原沉积现象更为严重。此外，通过免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）分析，我们还发现hetero cKO小鼠肾组织中纤维连接蛋白（Fibronectin）和F4/80（代表巨噬细胞成熟）的表达显著增加，这进一步支持了LONP1在抑制肾小球炎症反应中的作用。

为了进一步探索LONP1与SOD2之间的相互作用，我们进行了分子对接、表面等离子共振（SPR）和生物层干涉（BLI）实验，以量化它们的结合亲和力。结果显示，LONP1与SOD2的结合能为-138.30 ± 17.29 kcal/mol，而LONP1突变体（LONP1-MUT）与SOD2的结合能则显著降低至-43.27 ± 16.77 kcal/mol。这些数据表明，LONP1通过其分子伴侣功能，能够保护SOD2免受泛素化，从而维持其稳定性和活性，进而调节线粒体氧化还原平衡。这一机制可能在CKD的进展中起着至关重要的作用。

此外，我们还研究了LONP1在体外对系膜细胞（MCs）和足细胞（MPCs）的影响。通过将MCs与MAECs的培养上清液共培养，我们发现LONP1的沉默显著促进了Ang II诱导的系膜细胞增殖和足细胞损伤。这可能与LONP1缺失后导致的ROS异常释放和炎症因子的增加有关。通过透射电镜（TEM）分析，我们观察到在LONP1沉默的条件下，足细胞的足突融合和断裂现象更为严重，而LONP1的过表达则能够显著减轻这些病理变化。这些结果表明，LONP1在维持足细胞结构完整性方面具有重要作用，其缺失可能导致足细胞功能障碍，从而加剧肾小球硬化。

在探索LONP1对炎症反应的影响时，我们发现其沉默不仅导致了内皮细胞中炎症相关蛋白的增加，还通过影响邻近细胞（如系膜细胞和足细胞）的活性，进一步加重了炎症反应。通过转录组分析，我们发现LONP1沉默后，多个与炎症相关的基因表达显著上调，包括NLRP3、Plcg2、Tollip、Dusp10等。这些结果提示，LONP1可能通过调控这些炎症相关基因的表达，从而影响炎症反应的强度和范围。

我们还发现，SOD2的补充能够有效缓解LONP1缺失导致的内皮细胞损伤和肾小球硬化。通过使用SOD2模拟物MnTBAP处理5/6Nx小鼠，我们观察到肾小球胶原沉积和基底膜增厚现象显著减轻，同时尿蛋白和血清肌酐水平也有所下降。此外，MnTBAP的处理还显著降低了肾组织中Fibronectin和F4/80的表达，进一步验证了SOD2在维持内皮细胞功能和抑制炎症反应中的作用。这些结果表明，SOD2的补充可能为LONP1缺失导致的肾小球硬化提供一种有效的治疗策略。

在研究过程中，我们还发现LONP1的表达与细胞损伤程度密切相关。通过不同的刺激条件（如Ang II、醛固酮和过氧化氢），我们观察到LONP1的表达水平与细胞损伤程度呈负相关。这表明，LONP1在维持内皮细胞稳态和防止氧化应激相关损伤方面具有重要作用。此外，我们还发现LONP1的表达水平在不同组织和细胞类型中存在差异，这可能与不同细胞对LONP1依赖性的不同有关。

尽管本研究取得了一定的进展，但仍存在一些局限性。首先，我们使用的是内皮细胞特异性LONP1敲除小鼠，这可能无法全面反映LONP1在其他肾细胞类型中的作用。因此，未来的研究需要进一步探讨LONP1在不同细胞类型中的具体功能，以及其在维持多细胞协同损伤机制中的作用。其次，尽管我们发现了LONP1通过保护SOD2免受泛素化来稳定其表达，但具体的泛素化位点和相关的E3泛素连接酶仍需进一步研究。此外，我们的研究主要基于儿童CKD样本和模型，这可能无法完全代表成人CKD的发病机制，特别是那些由糖尿病、高血压或血管疾病引起的成人CKD。因此，未来的研究应扩展到成人CKD模型，以更好地理解LONP1在不同年龄段的肾病中的作用。最后，我们的研究使用的是年轻成年小鼠，这可能无法完全反映老年CKD的病理特征，如累积性氧化应激和炎性老化（inflammaging）。因此，未来的研究还需要在老年模型中进一步验证LONP1在年龄相关肾病中的作用。

综上所述，本研究揭示了LONP1在维持线粒体氧化还原平衡和细胞稳态中的重要作用。通过保护SOD2免受泛素化，LONP1能够有效抑制ROS的异常释放，从而减轻内皮细胞损伤和炎症反应。这一发现不仅为理解LONP1在CKD中的功能提供了新的视角，还为开发针对肾小球硬化的新型治疗策略提供了理论依据。未来的研究应进一步探索LONP1在不同细胞类型中的具体作用机制，以及其在多种病理条件下的潜在应用价值。