基于对70项含有农药活性成分的研究进行的体外代谢比较研究的监管经验——现实审视

《Regulatory Toxicology and Pharmacology》：Regulatory experience with the comparative in vitro metabolism study based on an analysis of 70 studies with pesticide active ingredients – a reality check

本研究系统分析了欧盟70项农药活性成分体外代谢比较研究，发现方法学差异显著，包括测试系统、物种选择、浓度设置等，导致结果可比性不足，代谢差异识别受限。亟需制定标准化指南以提高数据可靠性及风险评估效能。

　　农药的使用是现代农业不可或缺的一部分，它对于满足日益增长的人口对食物的需求至关重要。然而，由于其固有的毒性，农药在进入市场前必须经过严格的测试。在欧洲联盟（EU），自2013年起，对活性成分的体外代谢研究成为强制性要求。尽管如此，目前尚无统一的测试指南来规范这些研究的实施。因此，研究者们希望通过分析这些研究的实际应用情况，进一步探讨其方法学上的差异以及如何改进现有的测试策略，以更好地支持农药的安全评估。

### 体外代谢研究的重要性与现状

体外代谢研究的主要目的是比较人类与实验动物的代谢模式，从而判断动物实验数据对人类的适用性。这些研究在评估农药对人体健康和环境的影响方面具有重要价值，特别是在识别独特的人类代谢物（UHMs）或不成比例的人类代谢物（DHMs）时。然而，由于缺乏统一的测试指南，各研究之间在方法学上存在显著差异，这限制了数据的互用性和可靠性。研究者们发现，许多研究在选择实验系统、测试浓度、孵育时间以及技术重复次数等方面存在不一致，这可能导致对代谢物识别的偏差，影响风险评估的准确性。

### 研究样本与方法学分析

在本次研究中，共分析了70份体外代谢研究报告，涉及62种农药活性成分。其中，杀菌剂和除草剂是最常见的类别，分别占28和27项。这些研究的时间跨度从1989年到2021年，但绝大多数（63项）是在2013年之后进行的，即欧盟实施体外代谢研究强制性要求之后。研究中使用的实验系统主要包括肝脏组织，尤其是肝微粒体（69项），而只有少数使用肝细胞或S9制剂。尽管EFSA建议使用肝细胞作为首选的体外实验系统，但实际应用中，肝微粒体被更频繁地采用，这可能是因为其操作更为简便或成本更低。

### 实验系统与代谢物识别的挑战

肝微粒体虽然在体外代谢研究中被广泛使用，但其主要包含的是相I代谢酶，如细胞色素P450（CYPs），而相II代谢酶（如硫酸化和谷胱甘肽结合酶）则在肝微粒体中含量较少。因此，肝微粒体可能无法全面反映人体内的代谢过程。此外，一些研究并未遵循推荐的实验设计，例如仅使用单一浓度、过短的孵育时间或未进行技术重复。这些方法学上的不一致可能导致对代谢物识别的遗漏，进而影响对农药安全性的判断。

### 浓度与孵育时间的影响

在测试浓度方面，大多数研究（80%）仅使用单一浓度，而仅有少数（3%）使用三个或更多浓度。EFSA建议至少使用三种浓度（高、中、低），以提高代谢物识别的可能性。然而，当前的研究中，只有两项研究遵循了这一建议。此外，孵育时间的长短也会影响代谢物的形成。EFSA建议至少进行三个时间点的采样，但实际研究中，只有7项研究达到了这一要求。一些研究仅使用了较短的孵育时间（30至240分钟），这可能解释了为何某些研究未能检测到代谢产物，即使这些化合物在体内表现出明显的代谢行为。

### 技术重复与实验可靠性

技术重复是提高实验可靠性的关键因素之一。EFSA建议每个测试样本至少进行三次技术重复，但在分析中发现，只有37%的研究采用了三次重复，而32%的研究使用了两次重复，6%的研究仅进行了一次重复。这种不一致可能增加了实验结果的不确定性，导致对代谢物识别的误判。此外，对于使用肝细胞的研究，大多数都进行了细胞活性检测，以确保实验系统的适用性，但仍有少数研究未进行此类检测。

### 参考物质与正向对照的使用

为了确保实验系统的有效性，正向对照（如睾酮或7-乙氧基香豆素）被广泛使用，几乎所有研究（63项）都包含了正向对照。这些对照物质用于验证实验系统的代谢活性，确保实验条件适合代谢产物的检测。此外，部分研究还使用了负向对照来评估测试物质在孵育过程中的稳定性。然而，只有少数研究提供了代谢产物的结构信息，这限制了对代谢产物的深入分析和比较。

### 代谢产物的识别与物种差异

在识别代谢产物方面，研究者们发现，有些研究能够检测到独特的动物代谢产物（UMs）或不成比例的动物代谢产物（DMs），而另一些研究则未能检测到任何代谢产物。对于能够检测到代谢产物的研究，代谢产物的种类和数量在不同物种之间存在显著差异。这些差异可能反映了不同物种之间的代谢路径和速率的不同，从而影响农药在不同生物体内的毒性表现。因此，识别这些差异对于选择最相关的动物模型以评估人类风险至关重要。

### 推荐的改进措施

为了提高体外代谢研究的可靠性和可比性，研究者们建议制定统一的测试指南。这不仅有助于更准确地识别独特或不成比例的人类代谢产物，还可能支持下一代风险评估（NGRA）的发展。NGRA旨在减少对动物实验的依赖，采用新的方法学（NAMs）来评估农药的安全性。此外，建议在未来的研究中，采用更多样化的物种背景，以更好地理解农药在不同生物体内的代谢行为。

### 未来研究的方向

未来的体外代谢研究应更加注重方法学的标准化，包括实验系统的选择、测试浓度、孵育时间以及技术重复次数。同时，建议使用更全面的实验系统，如肝细胞，以确保相I和相II代谢酶的检测。此外，代谢产物的结构鉴定和命名应统一，以便更有效地比较体外与体内代谢数据。最后，对于非肝脏组织的代谢研究，应进一步探索其在风险评估中的作用，以全面了解农药在不同器官中的代谢行为。

### 结论

综上所述，当前的体外代谢研究在方法学上存在显著差异，这限制了其在农药安全评估中的应用。为了提高研究的可靠性和可比性，制定统一的测试指南是迫切需要的。这将有助于更准确地识别独特或不成比例的人类代谢产物，支持下一代风险评估的发展，并减少对动物实验的依赖。同时，建议未来的研究更加注重方法学的标准化，以确保实验结果的准确性和可靠性。