一种基于异佛尔酮的新型比率荧光探针，用于细胞和斑马鱼中次氯酸的成像

《Spatial and Spatio-temporal Epidemiology》：A novel ratiometric fluorescent probe based on isophorone for hypochlorous acid imaging in cells and zebrafish

HOCl检测新探针开发及其在细胞和动物模型中的应用。基于异羟肟酮骨架的探针IPH1实现200nm Stokes位移和90nm双发射分离，检测限29nM，具有高灵敏度和选择性的实时成像能力，成功应用于活细胞HOCl生成追踪和斑马鱼模型中的动态监测。

　　

李书婷|范嘉欣|杨荣斌|韩一峰

浙江科技学院化学系，中国杭州310018

摘要

次氯酸（HOCl）的失调与炎症和神经退行性疾病有关，因此需要精确的工具来对其进行实时追踪。在这项研究中，开发了一种基于异佛尔酮的新型比率探针（IPH1）用于检测HOCl。IPH1利用HOCl引发的其

-氨基苯酯部分的氧化断裂，释放出氨基异佛尔酮荧光团，从而产生90纳米的比率发射位移，并具有200纳米的记录Stokes位移。IPH1具有超高灵敏度（LOD = 29 nM）、选择性和快速响应（t_1/2 = 15 s）。通过对外源性和内源性HOCl以及在活细胞中的MPO衍生的HOCl进行比率成像，以及实时追踪斑马鱼中的HOCl动态，验证了其实用性。将异佛尔酮的光物理优势与合理的触发策略相结合，为研究HOCl的生物学特性提供了强大的工具。

引言

次氯酸（HOCl）是一种关键的活性氧（ROS），在生理防御和病理损伤中扮演双重角色。它通过髓过氧化物酶（MPO）催化的H₂O₂和Cl^?的过氧化反应内源性生成，在免疫反应中作为有效的抗菌剂，有效中和入侵的病原体[1]。然而，HOCl的产生失调与多种病理状况有关，包括慢性炎症、心血管并发症、神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）以及癌症进展[2]。MPO-HOCl轴已成为早期诊断关节炎和类风湿性关节炎等炎症性疾病的关键生物标志物[3]。因此，高时空分辨率的HOCl动态实时监测对于阐明其病理生理作用和开发靶向治疗策略至关重要[4,5]。

由于荧光探针的非侵入性、卓越的灵敏度以及与活细胞成像的兼容性，它们已成为检测HOCl不可或缺的工具[[6], [7], [8]]。当前的分子设计主要利用HOCl特异性反应，包括硫醚/硒醚中的硫（S/Se/Te）氧化、罗丹明衍生物中的硫螺内酯环开环、二氨基马来腈基团的脱保护，以及CC键或肟衍生物的氧化断裂[[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38]]。

尽管取得了显著进展，现有的HOCl探针仍存在一些关键限制：1) 大多数比率探针的发射峰分离小于70纳米，导致光谱串扰，从而影响复杂基质中的定量准确性；2) 常规荧光团（如BODIPY、荧光素）的Stokes位移通常小于100纳米，导致自吸收伪影，降低信噪比[39,40]；3) 检测灵敏度有限，难以追踪早期病理过程中的内源性HOCl波动（20–200 nM范围）[41]。至关重要的是，对于在HOCl主要产生的亚细胞微环境中动态监测MPO-HOCl途径的有效工具仍然是一个未满足的需求。

为了解决上述挑战，我们开发了一系列基于异佛尔酮荧光团的新型探针（IPH1-IPH3），异佛尔酮以其较大的Stokes位移和近红外（NIR）发射特性而闻名[42]。其中，IPH1以

-氨基苯氨基甲酸酯作为反应触发剂，对HOCl表现出优异的比率响应。暴露于HOCl时，

-氨基苯部分发生氧化脱保护，释放出红移的异佛尔酮胺荧光团。这种转化导致200纳米的显著Stokes位移和从550纳米到640纳米的双重发射位移（Δλ = 90纳米），有效消除了自吸收，实现了高保真的比率成像。除了对HOCl的优异灵敏度和选择性外，IPH1还成功应用于监测活细胞中的HOCl生成、可视化髓过氧化物酶（MPO）介导的HOCl生成，并在斑马鱼模型中成像内源性HOCl。这项工作通过将异佛尔酮骨架的光物理优势与合理的触发基团策略相结合，为HOCl探针设计建立了新的范式，为探索复杂活系统中的HOCl生物学特性提供了强大的工具。

合成方法

合成

详细的实验材料、仪器和探针合成过程在ESI中描述。

体外光谱表征

在室温条件下制备了IPH1、IPH2和IPH3的储备溶液（10 mM溶于DMSO）。进行光谱测量时，将50 μL储备溶液转移到5 mL容量瓶中，然后加入10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，含50% EtOH）至总体积的约98%。通过各自的储备溶液引入目标分析物

合成

图2概述了探针IPH1-IPH3的合成路线。首先，在哌啶作为碱催化剂的存在下，异佛尔酮（1）与马来腈缩合生成二氰异佛尔酮（2）。该中间体随后在哌啶的催化下与

-硝基苯甲醛发生缩合，生成硝基取代的异佛尔酮衍生物（3）。然后使用Fe/NH₄Cl体系还原硝基，生成相应的胺功能化产物

结论

本研究成功开发了一种基于异佛尔酮的新型比率探针IPH1，通过其

-氨基苯酯部分的氧化断裂来检测HOCl。IPH1具有较大的Stokes位移（200 nm）和双重发射分离（90 nm），显著减少了自吸收，实现了准确的比率成像。IPH1对HOCl的检测限为29 nM，具有高选择性和宽pH耐受性。IPH1已成功应用于比率成像

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了浙江省自然科学基金（授权号：LY17B070008）的支持。