一种高度灵敏且可再生的电化学免疫传感器芯片，用于检测血液中的脂联素

《Talanta》：A highly sensitive and regenerable electrochemical immunosensor chip for blood adiponectin detection

新型电化学免疫传感器芯片基于金纳米颗粒修饰和微流控技术，实现高灵敏度（3.03 μA/decade）、宽线性范围（0.5–25,000 ng/mL）及低检测限（0.0093 ng/mL）的 adiponectin 检测，支持连续流式操作和多次再生使用，为2型糖尿病早期筛查提供可靠平台。

　　

孙春杰|刘家乐|徐成涛|谭志光|于海霞|李大超

天津大学精密测量技术与仪器国家重点实验室，天津，300072，中国

摘要

由于2型糖尿病（T2DM）已成为全球最严重的公共卫生问题之一，实现早期筛查和敏感诊断具有重要意义。脂联素被广泛认为是T2DM的重要生物标志物，由于其在疾病可逆前期的负相关关系，具有较高的准确性和敏感性。本研究开发了一种新型可重复使用的电化学免疫传感器芯片，用于检测脂联素，以促进T2DM的早期预警和干预。脂联素抗体被固定在工作电极上，电极表面经过金纳米粒子（AuNPs）修饰。测量结果显示，在14次再生循环后，该传感器的灵敏度为3.03 μA/decade，线性范围为0.5–25,000 ng/mL，检测限（LOD）为0.0093 ng/mL。将传感单元集成到流式细胞仪中，不仅能够降低试剂消耗并实现连续流动操作，还能使免疫传感器表现出优异的重复性、再现性和抗干扰能力。最终，所提出的免疫传感器能够对真实血液样本进行精确测量，为未来T2DM临床诊断的研究和应用奠定了基础。

引言

糖尿病（DM）是一种慢性代谢紊乱疾病，其特征是胰岛素分泌不足和胰岛素作用受损，导致血糖水平持续升高[1]。过去几十年里，全球糖尿病的患病率持续上升，已成为一个关键的公共卫生挑战[2]。2型糖尿病（T2DM）约占所有糖尿病病例的90%，通常会引起多系统损害，包括心血管、眼部、血管、肾脏和神经系统等，导致严重并发症并显著降低预期寿命[[3]，[4]，[5]]。然而，目前基于血糖水平的诊断标准缺乏检测代谢异常的敏感性，尽管在长期的糖尿病前期就已经存在胰岛素抵抗和葡萄糖及脂质代谢紊乱[[6]，[7]，[8]，[9]]。脂联素通常被用作早期风险预测的重要生物标志物，因为其循环水平在糖尿病发病前多年就会显著下降，并且不受短暂生理因素的影响[[10]，[11]，[12]，[13]，[14]]。快速灵敏的脂联素检测技术的研究对于在可逆阶段进行早期干预和延缓疾病进展非常重要。

目前，常见的脂联素检测方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）[15]、放射免疫测定[16]、免疫浊度法[17]和质谱法[18]通常受到复杂程序、长处理时间、对大型仪器的依赖以及高成本的限制，这些因素限制了它们在早期筛查中的广泛应用[[19]，[20]，[21]]。近年来，电化学生物传感器因其紧凑的尺寸、高灵敏度、高特异性、操作简便性、快速检测和低成本等优点而受到广泛关注[[22]，[23]，[24]，[25]]。Sobrova等人使用碳糊电极研究了基于吸附转移剥离方波伏安法的脂联素电化学行为，在标准溶液中获得了0.239 nA/(ng/mL)的灵敏度，但线性范围较窄[26]。Ince等人开发了一种基于氧化铟锡（ITO）电极的经济型脂联素免疫传感器，在实际人血清样本中检测限（LOD）为148 pg/mL，线性范围为25–2500 pg/mL[27]。然而，这些免疫传感器设计为一次性使用，或在每次再生循环后容易受到部分损坏，从而限制了其重复使用。Ozcan等人提出了一种使用石墨纸作为工作电极的新生物传感器，检测限为0.0033 pg/mL，但其较大的电极面积（20 × 21 cm2）需要相对较大的血液样本体积[28]。总体而言，这些传感器的灵敏度较低、线性范围狭窄或不能重复使用，这限制了它们在生物医学领域的实际应用。

本文提出了一种用于检测脂联素的紧凑型微流控芯片电化学免疫传感器。为了实现特异性检测，通过自组装单层（SAM）将脂联素抗体固定在金纳米粒子（AuNPs）的表面，并用其修饰免疫传感器的工作电极。通过优化制备和再生过程，提高了检测灵敏度、线性检测范围和再生能力。结合微流控芯片，该免疫传感器能够实现对血液中脂联素的连续流动检测，具有可靠的性能，为早期糖尿病筛查提供了快速准确的平台，并为实际临床应用带来了巨大前景。

试剂

脂联素和脂联素抗体购自Medix Biochemica Oy。N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺（EDC，E684250，95%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，H109330，98%）和氢氧化钠（NaOH，98%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。三氯化铁（FeCl?，98%）和铁氰化钾（K?[Fe(CN)?]，99.7%）购自天津大茂化学试剂有限公司。铁氰化钾（K?[Fe(CN)?]，98%）、氯化钾

抗脂联素抗体的固定步骤

如图2所示，不同修饰状态下的脂联素免疫传感器进行了表征。通过SEM观察了电极表面上AuNPs的形态和随机分布（图2a）。XPS分析证实了11-MUA在工作电极上的成功修饰，S2p峰位于162 eV（图2b）。此外，XPS分析还证明了EDC/NHS处理的成功以及脂联素抗体的固定，N 1s信号显著增强（图2c）。

结论

本研究提出了一种基于脂联素抗体和脂联素特异性识别原理的新型电化学免疫传感器芯片，在血液样本中实现了出色的脂联素检测性能。该免疫传感器采用11-MUA SAM和EDC/NHS介导的共价耦合，将脂联素抗体稳定固定在工作电极上。经过AuNPs修饰后，电化学特性得到了显著提升。所提出的免疫传感器芯片表现出

CRediT作者贡献声明

孙春杰：方法学、研究、数据分析、概念化。刘家乐：软件、数据分析。徐成涛：方法学、概念化。谭志光：方法学、数据分析。于海霞：写作-审稿与编辑、研究、资金获取、数据分析。李大超：资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFB3203700）、精密测量技术与仪器国家重点实验室和天津大学（编号：PILAB2407）的资助。