猪链球菌2型荚膜多糖结合疫苗的研制及其免疫学评估

《Urology Video Journal》：Development and immunological evaluation of a Streptococcus suis serotype 2 capsular polysaccharide conjugate vaccine

SS2的 capsular polysaccharide (CPS2)纯化方法及疫苗开发研究，通过聚乙烯亚胺核酸沉淀结合酚蛋白变性，实现高效CPS2制备（克级/升）。实验表明CPS2的唾酸基团对体液免疫影响有限，原CPS2-OVA共轭疫苗在猪中诱导高IgG应答并显著降低致病性SS2攻击的发病率。优化佐剂组合（铝佐剂vs. TLR激动剂）显示铝佐剂可增强抗体亲和力。本研究建立了CPS2标准化制备平台，为开发广谱链球菌疫苗奠定基础。

　　在本研究中，我们针对一种重要的动物源性病原体——猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，简称SS2）进行了深入探讨。SS2作为一种重要的动物源性病原体，不仅对猪群造成严重的健康威胁，同时也能够感染人类，尤其是那些与猪或猪肉制品有密切接触的工作人员。这种细菌能够引起多种严重的系统性感染，如脑膜炎、败血症、关节炎和心内膜炎等，给全球的畜牧业和公共卫生带来了巨大的负担。然而，目前尚无有效的疫苗能够完全预防SS2感染，这使得研究其免疫特性及开发新的疫苗策略成为紧迫的科学任务。

我们研究的重点是SS2的荚膜多糖（capsular polysaccharide，简称CPS2）。作为一种重要的病原体结构成分，CPS2在细菌的致病过程中扮演着关键角色。它能够帮助细菌逃避宿主的免疫系统，通过掩盖其表面的免疫原性成分，从而抑制宿主先天免疫细胞对其的识别和清除。尽管如此，CPS2的结构特征如何影响宿主的免疫反应仍不明确。因此，本研究旨在通过建立一种新的、可靠的CPS2纯化方法，以更高效地获取这种多糖，并进一步探讨其在疫苗开发中的潜力。

为了实现这一目标，我们从40株临床分离的SS2菌株中筛选出了一株生长速度较快的菌株。该菌株的选取基于其发酵后的OD值以及生长速度，这为我们后续的多糖提取工作提供了理想的菌株来源。在纯化过程中，我们采用了一种结合聚乙烯亚胺（polyethylenimine，简称PEI）介导的核酸沉淀和酚类蛋白变性技术的新方法。这种方法不仅避免了传统柱层析法的繁琐步骤，还能够在每升培养物中实现克级CPS2的高效回收，同时保持其结构的完整性。这一技术的突破为大规模生产CPS2奠定了基础，也为后续的疫苗开发提供了高质量的原材料。

在纯化之后，我们进一步研究了CPS2的结构特征，特别是其是否含有唾液酸（sialic acid）对疫苗诱导的抗体反应的影响。我们通过比较天然CPS2和去唾液酸化的CPS2与蛋白质载体结合后在小鼠体内引发的抗体反应，发现唾液酸的存在与否对疫苗诱导的抗体水平没有显著影响。这一结果表明，尽管唾液酸可能在细菌的免疫识别中起到一定作用，但在疫苗开发中，其对诱导宿主产生针对CPS2的抗体反应的贡献有限。因此，我们可以专注于使用天然CPS2作为疫苗的免疫原，而不必过分担忧其唾液酸含量对免疫效果的影响。

基于这一发现，我们进一步在猪群中评估了天然CPS2与蛋白质载体结合的疫苗效果。结果表明，这种疫苗能够有效诱导猪体内针对CPS2的IgG抗体反应，并且在对致病性SS2的挑战实验中表现出显著的保护效果。这说明，CPS2作为疫苗的抗原成分具有良好的免疫原性，能够激发宿主产生针对该病原体的免疫应答。此外，我们还对不同佐剂和剂量对疫苗效果的影响进行了系统研究，发现适当的佐剂和剂量可以进一步增强疫苗的免疫效果，提高其在实际应用中的保护能力。

本研究还探讨了多种疫苗策略，包括使用卵白蛋白（ovalbumin）、破伤风类毒素（tetanus toxoid）或CRM197作为载体蛋白的糖蛋白疫苗。其中，一项研究利用破伤风类毒素作为载体，成功开发出一种能够在猪群中实现约70%保护率的糖蛋白疫苗。这一成果为糖蛋白疫苗的可行性提供了有力的证据。然而，传统的化学偶联方法在实际应用中仍然存在一些挑战，例如产物的偶联比例不稳定，导致质量控制和工业生产过程中出现困难。为了解决这些问题，我们引入了一种基于生物素（biotin）和链霉亲和素（rhizavidin）的偶联策略，该方法具有操作简便、可控性强和重复性高的优点，能够实现更精确的分子组装，提高疫苗批次的一致性。

在疫苗开发过程中，我们还发现，单纯的抗体生成并不足以确保细菌的清除。一些基于多组分蛋白的疫苗虽然能够诱导强烈的抗原特异性IgG反应，但在对SS2的挑战实验中，未能有效降低细菌在血液中的存活率或减少感染后的发病率。这表明，针对SS2的疫苗设计需要更加全面地考虑宿主免疫系统的多种机制，而不仅仅是依赖于体液免疫。因此，我们提出了一个更加综合的疫苗策略，即通过优化糖蛋白疫苗的结构，使其能够更好地激活宿主的先天免疫和适应性免疫，从而实现更全面的保护效果。

在实验设计方面，我们选择了SS2菌株S0031作为多糖提取的来源。该菌株是在2018年从一头病猪的临床样本中分离得到的，虽然其序列类型尚未确定，但其在实验中的表现证明了其作为研究对象的可行性。为了确保实验的严谨性，我们还使用了专门的猪源性无菌培养基，并从多个生物技术公司购买了相关的实验材料，如胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板和新生牛血清等。这些材料的选用保证了实验的重复性和可靠性，同时也为后续的疫苗制备提供了良好的基础。

在疫苗的制备过程中，我们对不同类型的蛋白质抗原进行了评估。最终，我们选择了一种与肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）相关的蛋白质抗原SP0435，并将其与生物素修饰的CPS2进行偶联，从而生成了一种新的糖蛋白疫苗候选物。这种疫苗的制备过程充分考虑了宿主免疫系统的反应机制，旨在通过优化抗原结构，提高其在宿主体内的免疫激活能力。实验结果表明，这种疫苗在小鼠和猪群中均能有效诱导针对CPS2的IgG抗体反应，并且在猪群中表现出较高的保护率，这一发现为SS2疫苗的开发提供了重要的实验依据。

此外，我们还对疫苗的生产过程进行了系统的优化，确保其能够在大规模生产条件下保持稳定的质量和免疫活性。通过多次独立的生产批次验证，我们确认了所采用的纯化方法和偶联策略的可靠性和可重复性。这不仅为疫苗的工业化生产提供了技术支持，也为未来的临床试验和应用奠定了基础。我们相信，这种新型的糖蛋白疫苗候选物有望成为预防SS2感染的有效手段，为畜牧业和公共卫生领域带来新的希望。

在本研究中，我们还强调了疫苗开发中需要考虑的多个方面，包括抗原的结构特征、佐剂的选择、剂量的优化以及宿主免疫系统的反应机制等。通过综合分析这些因素，我们提出了一种更加科学和系统的疫苗开发策略。这一策略不仅关注于抗原的免疫原性，还考虑了疫苗在实际应用中的安全性和有效性。我们希望，通过本研究的成果，能够为未来的SS2疫苗研发提供有价值的参考，并推动相关技术的进一步应用。

总的来说，本研究通过开发一种高效、可靠的CPS2纯化方法，结合生物素-链霉亲和素偶联策略，成功构建了一种新型的糖蛋白疫苗候选物。该疫苗在小鼠和猪群中均表现出良好的免疫应答和保护效果，为SS2的疫苗开发提供了新的思路和技术支持。未来，我们计划进一步优化疫苗的结构和配方，并进行更广泛的动物实验和临床试验，以验证其在实际应用中的效果。我们相信，这种新型疫苗有望成为预防SS2感染的重要工具，为改善公共卫生和促进畜牧业健康发展做出贡献。