从流产的犬胎儿中分离出的布鲁氏菌（Brucella canis）的鉴定与系统发育分析

《Veterinary Microbiology》：Identification and Phylogenetic Analysis of a Brucella canis Isolate from an Aborted Canine Fetus

犬猫呼吸道病原体Mycoplasma cynos和Mycoplasma felis的体外抗菌活性及基因组分析显示，四环素类对两者均保持高敏感性，但氟喹诺酮和 макролид耐药性存在差异。gyrA基因SNP（如Tyr154Ala/Ile和Ser137Tyr）与氟喹诺酮耐药相关，23S rRNA突变（如A2058G和C1187T）与 макролид耐药性相关。通过全基因组测序发现，病原体携带大量与宿主粘附（如hapA、opp operon）和免疫逃逸相关的毒力基因，并首次鉴定到L4蛋白Val43Leu突变。研究为支原体耐药机制和靶向治疗提供依据。

　　这项研究聚焦于犬和猫中两种重要的呼吸道病原体——**Mycoplasma cynos**（犬支原体）和**Mycoplasma felis**（猫支原体）的抗菌药物敏感性及潜在致病性基因的分析。支原体是一类缺乏细胞壁的细菌，因其在培养上的困难性，长期以来在研究上受到限制，导致对其致病机制、抗菌药物耐药性和诊断手段的了解较为有限。因此，本研究旨在通过体外抗菌药物敏感性测试和基因组分析，为临床治疗提供科学依据，并揭示这些病原体的潜在致病机制。

### 研究背景与意义

在犬和猫中，Mycoplasma cynos 和 Mycoplasma felis 分别是犬传染性呼吸道疾病复合体（CIRDC）和猫传染性呼吸道疾病复合体（FRDC）的主要致病菌之一。CIRDC通常被称为“犬群咳嗽”，是一种高度传染性的呼吸道疾病，临床表现包括轻微咳嗽和流涕，甚至发展为严重的气管支气管炎和致死性肺炎。而FRDC则在猫中表现为上呼吸道和下呼吸道症状、结膜炎以及牙龈炎等。由于这些病原体在培养上非常困难，其抗菌药物敏感性、致病机制和诊断工具的发展一直滞后。因此，明确这些病原体对常用抗菌药物的敏感性，不仅有助于优化治疗方案，还能为疾病的防控提供新的思路。

当前，针对支原体相关呼吸道感染的治疗通常依赖于经验性用药，常用的包括四环素类（如多西环素、四环素和米诺环素）、氟喹诺酮类（如马波氟喹诺酮、恩诺沙星和培氟沙星）以及大环内酯类（如阿奇霉素）。然而，由于缺乏系统的体外抗菌药物敏感性研究，医生无法准确判断这些药物对病原体的有效性，也无法评估治疗失败是否与耐药性相关。此外，支原体的某些特性，如缺乏细胞壁和无法合成叶酸，使其对β-内酰胺类抗生素和磺胺类药物具有固有耐药性。而在其他人类和动物病原体中，如Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma amphoriforme、Mycoplasma bovis、Mycoplasma ovipneumoniae、Mycoplasma hyopneumoniae和Mycoplasma gallisepticum，已经发现氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性普遍存在，这进一步凸显了研究M. cynos和M. felis抗菌药物敏感性的重要性。

### 方法与技术手段

为了评估这些病原体的抗菌药物敏感性，研究人员开发了一种改良的**肉汤微量稀释法**，并结合**基因组测序**技术，对耐药性和致病性相关的基因进行分析。具体来说，通过**Oxford Nanopore**和**Illumina**两种测序技术，研究人员构建了两种病原体的混合基因组，并利用**基因组分析和分子标记检测（WADE）**程序，提取并比对了关键基因的序列，如**gyrA**（与氟喹诺酮类耐药性相关）、**23S rRNA**（与大环内酯类耐药性相关）以及**50S L4蛋白**（与阿奇霉素耐药性相关）。

为了确保抗菌药物测试的准确性，研究人员首先通过**颜色变化单位（CCU）**法确定菌株的初始浓度。这一方法基于菌体在特定培养基中生长后引起的颜色变化，通过连续稀释来计算单位体积内的菌量。然后，利用该浓度进行**肉汤微量稀释法**，测试不同抗菌药物的最小抑制浓度（MIC）。测试的抗菌药物包括多西环素、四环素、米诺环素、恩诺沙星、马波氟喹诺酮和阿奇霉素。通过观察培养基的颜色变化，研究人员能够确定每种药物的MIC值，即在特定浓度下，菌体不再生长的最低药物浓度。

此外，研究人员还通过**Bakta**工具对基因组进行了全面的编码序列（CDS）注释，并结合**UniProt**数据库和文献检索，筛选出可能与致病性相关的基因。这些基因包括与粘附、免疫逃逸、生物膜形成和细胞损伤相关的基因。通过这些分析，研究人员能够识别出潜在的致病因子，并进一步探讨其在疾病发生中的作用。

### 体外抗菌药物敏感性结果

研究结果显示，M. cynos和M. felis在四环素类药物（如多西环素、四环素和米诺环素）方面表现出高度的敏感性。所有12个M. cynos和16个M. felis菌株在最低测试浓度下均被抑制，表明四环素类药物在治疗这些病原体相关感染时具有较高的疗效。相比之下，氟喹诺酮类药物（如恩诺沙星和马波氟喹诺酮）对这两种菌株的抑制效果则表现出较大的个体差异。例如，M. cynos的MIC值范围从≤0.125 μg/mL到16 μg/mL，而M. felis的MIC值则从≤0.125 μg/mL到≥128 μg/mL。这表明部分菌株对氟喹诺酮类药物存在耐药性，可能与**gyrA**基因的突变有关。

具体来说，在M. cynos中，3/11（27.3%）菌株在Tyr154位点发生了突变，包括Tyr154Ala和Tyr154Ile两种形式，这些突变与恩诺沙星和马波氟喹诺酮的高MIC值相关。而在M. felis中，12.5%（2/16）菌株在Glu141位点发生了Gly突变，而18.8%（3/16）菌株在Ser137和Asp150位点发生了Tyr和Asn突变。这些突变与阿奇霉素的高MIC值相关，进一步支持了这些菌株对大环内酯类药物的耐药性。

对于阿奇霉素的耐药性，研究发现M. felis的MIC值普遍较高，部分菌株的MIC值甚至达到≥64 μg/mL。这可能与**23S rRNA**的突变以及**50S L4蛋白**的Val43Leu突变有关。研究人员发现，50S L4蛋白的Val43Leu突变在M. felis中出现频率较高，且与更高的阿奇霉素MIC值相关，这表明该突变可能在耐药性形成中起到了关键作用。此外，部分菌株在23S rRNA中出现了C1187T突变，这与阿奇霉素的耐药性也有关联。

### 基因组分析与耐药性机制

通过对M. cynos和M. felis的基因组进行分析，研究人员发现这两种病原体在耐药性基因的分布上存在显著差异。在四环素类药物耐药性方面，未发现与M. cynos和M. felis相关的**16S rRNA**基因突变，也没有检测到**tet(M)**基因介导的耐药性。这表明四环素类药物对这两种病原体具有较高的体外敏感性，可以作为一线治疗药物。

对于氟喹诺酮类药物耐药性，研究人员发现**gyrA**基因的突变是关键因素。在M. cynos中，Tyr154Ala/Ile突变与恩诺沙星和马波氟喹诺酮的高MIC值相关，而在M. felis中，Ser137Tyr/Ile、Glu141Gln/Gly和Asp150Asn突变也与耐药性相关。尽管这些突变在M. cynos和M. felis中均被检测到，但M. felis的耐药性表现更为复杂，可能还涉及其他基因如**parC**的突变。此外，研究人员还发现，M. felis中某些菌株的**23S rRNA**和**50S L4蛋白**均存在耐药性相关的突变，这表明耐药性可能是多因素共同作用的结果。

在大环内酯类药物耐药性方面，研究发现**23S rRNA**的A2058G突变在M. cynos和M. felis中均存在。然而，M. felis的耐药性更为显著，部分菌株的MIC值达到≥64 μg/mL，这与**50S L4蛋白**的Val43Leu突变密切相关。此外，研究人员还发现，M. felis中存在一些未被广泛研究的突变，这些突变可能在耐药性形成中起到重要作用。因此，阿奇霉素的MIC值在M. felis中表现出较大的变异，这可能与多种基因突变共同作用有关。

### 致病性基因的发现与分析

通过基因组分析，研究人员还发现了M. cynos和M. felis中与致病性相关的基因。这些基因主要涉及**粘附**、**免疫逃逸**和**生物膜形成**等过程。例如，M. cynos和M. felis的基因组中均含有与粘附相关的基因，这些基因与M. pneumoniae的P1粘附复合体具有高度同源性。此外，一些**moonlighting蛋白**如DnaK和延长因子Tu也被发现可能在粘附过程中起到重要作用。

在免疫逃逸方面，研究人员发现M. cynos和M. felis的基因组中存在**Mycoplasma免疫球蛋白结合蛋白（MIB）**和**Mycoplasma免疫球蛋白蛋白酶（MIP）**，这些蛋白可能通过调节宿主免疫反应来帮助病原体逃避免疫系统的识别和攻击。此外，**生物膜形成相关基因**也被发现，这些基因在M. gallisepticum的研究中被证明对生物膜的形成至关重要。M. cynos和M. felis的基因组中也存在类似基因，表明它们可能通过形成生物膜来增强在宿主组织中的生存能力和抗药性。

### 研究意义与未来展望

这项研究首次对M. cynos和M. felis的抗菌药物敏感性和致病性基因进行了系统的分析，为临床治疗提供了重要的参考依据。研究结果表明，四环素类药物在治疗这两种病原体相关感染时具有较高的体外敏感性，可以作为一线治疗药物。而氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性则需要进一步关注，尤其是在治疗失败的情况下，可能与这些药物的耐药性突变有关。

此外，研究还揭示了M. cynos和M. felis在致病机制上的相似性，尤其是粘附和免疫逃逸方面。这些发现不仅有助于理解这两种病原体的致病性，也为未来开发更有效的诊断工具和治疗策略提供了理论基础。例如，通过检测特定的耐药性基因突变，可以更准确地预测病原体对药物的敏感性，从而优化治疗方案。

然而，研究也指出了一些需要进一步探索的问题。例如，M. felis的耐药性表现更为复杂，可能涉及多个基因突变的共同作用，而不仅仅是**gyrA**或**23S rRNA**的突变。因此，未来的研究需要进一步探讨这些病原体对其他抗菌药物的敏感性，以及耐药性基因的动态变化。此外，生物膜形成和粘附机制的具体作用仍需深入研究，以明确其在疾病进展中的角色。

总的来说，这项研究不仅填补了M. cynos和M. felis抗菌药物敏感性方面的空白，还为理解其致病机制提供了新的视角。这些发现对于改善犬猫呼吸道感染的诊断和治疗具有重要意义，同时也为后续研究提供了重要的基础数据。未来，随着更多研究的开展，我们有望进一步揭示这些病原体的耐药性和致病性，从而为临床实践提供更科学的指导。