牛分枝杆菌与结核分枝杆菌VapBC3毒素-抗毒素系统的比较生物信息学分析：揭示物种特异性生存策略的结构基础

《Scientific Reports》：Comparative in silico analysis of vapBC3 toxin-antitoxin system in Mycobacterium Bovis and Mycobacterium tuberculosis

本研究针对结核分枝杆菌复合群中高度保守的毒素-抗毒素(TA)系统开展比较分析，重点关注VapBC3系统在牛分枝杆菌(M. bovis)和结核分枝杆菌(M. tuberculosis)中的物种特异性差异。研究人员通过生物信息学分析和分子对接模拟，发现M. bovis的vapC3基因存在核苷酸缺失突变，导致产生截短型VapC3毒素蛋白(109个氨基酸)，而M. tuberculosis的VapC3则包含137个氨基酸。分子对接结果显示M. bovis的VapBC3复合物具有更稳定的相互作用(HADDOCK score: 20.4±5.4)，这一发现为理解两种病原体在宿主适应性、抗生素耐受性和毒力策略方面的差异提供了新的结构见解，对开发针对TA系统的抗菌策略具有重要意义。

　　

结核病至今仍是全球面临的重大公共卫生挑战，每年新增病例约1000万例。引起该病的元凶——结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)拥有一套精妙的机制来逃逸宿主免疫系统并在体内长期潜伏。其中，毒素-抗毒素(TA)系统作为细菌的关键生存工具，在应激反应、休眠状态和抗生素耐药性形成中发挥着核心作用。在分枝杆菌中，VapBC(毒力相关蛋白B和C)是数量最丰富的II型TA系统家族，包含约50个亚家族，其中VapBC3因在细菌胞内生存中的潜在作用而备受关注。

与结核分枝杆菌亲缘关系极为接近的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是结核分枝杆菌复合群的重要成员，其基因组相似度超过99.95%，但在宿主偏好性和毒力因子方面存在差异。牛分枝杆菌主要引起人畜共患结核病，经常表现为肺外结核，对畜牧业和公共卫生构成双重威胁。理解这两种病原体的分子差异对于开发针对性治疗策略至关重要。

尽管TA系统在结核分枝杆菌复合群中高度保守，但细微的序列变异可能导致物种特异性功能差异，进而影响宿主适应、抗生素耐受和毒力策略。为此，伊朗研究团队开展了这项比较生物信息学研究，旨在揭示VapBC3系统在两种重要病原体中的结构功能差异。

研究人员采用了多项生物信息学技术手段：从临床分离株中获取基因序列数据，利用MEGA 7和SnapGene 5.3.1进行多序列比对和进化分析；通过AlphaFold预测蛋白质三维结构，借助UCSF ChimeraX进行可视化分析；最后使用HADDOCK 2.4进行分子对接模拟，评估蛋白质-蛋白质相互作用稳定性。研究涵盖了16株利福平敏感和耐药结核分枝杆菌分离株以及12株利福平敏感和耐药牛分枝杆菌分离株，并以M. tuberculosis H37Rv和M. bovis BCG作为参考菌株进行对比分析。

突变在毒素-抗毒素模块中的发现

通过对VapB3抗毒素的序列比较发现，在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的利福平敏感和耐药分离株中，该抗毒素的88个氨基酸序列完全一致，表明VapB3在两种物种间高度保守。

VapC3突变及其结构意义

研究发现了关键差异：所有牛分枝杆菌分离株的vapC3基因第719位核苷酸均存在缺失突变。结核分枝杆菌的VapC3毒素由137个氨基酸组成，而牛分枝杆菌中的核苷酸缺失导致产生截短型蛋白，仅含109个氨基酸。这一结构变化显著改变了蛋白质的翻译模式和空间构象。

AlphaFold结构预测和ChimeraX可视化分析清晰展示了两种物种VapC3蛋白的结构差异。牛分枝杆菌的VapC3蛋白明显较短，这种截短效应可能影响其与配体的结合能力和生物学功能。

分子对接分析

分子对接结果揭示了两种物种VapBC3相互作用的显著差异。牛分枝杆菌的VapBC3复合物表现出更强的结合亲和力(HADDOCK score: 20.4±5.4)，明显优于结核分枝杆菌(73.9±11.0)。从最低能量结构的RMSD值来看，牛分枝杆菌(3.3±0.4)也显著低于结核分枝杆菌(16.2±0.3)，表明前者形成了更稳定的对接构象。

关键相互作用能量参数进一步证实了这一差异：虽然范德华能量和静电能量在两种物种间相对接近，但去溶剂化能量存在明显差别。结核分枝杆菌显示出更高的埋藏表面积(3446.2±119.4)和约束违反能量(2284.2±135.2)，而牛分枝杆菌的相应值分别为3197.4±175.2和1550.7±38.3。Z-score分析也支持牛分枝杆菌VapBC3相互作用具有更高置信度的结论。

研究结论强调，结核分枝杆菌复合群中毒素-抗毒素系统存在的细微结构变异可能具有重要的生物学意义。牛分枝杆菌VapC3毒素的截短突变导致其与抗毒素VapB3的相互作用更加稳定，这种物种特异性差异可能影响TA系统的调控功能，进而与细菌的适应能力、持久性和潜在抗生素耐药性发展相关。

分子对接结果支持了这一观点：即使高度保守的生物学系统也可能因微小结构变化而产生显著功能差异。特别值得注意的是，牛分枝杆菌VapC3蛋白序列C末端存在精氨酸残基，这可能部分解释了该蛋白更高亲和力的现象，因为带正电荷的残基通常能够增强蛋白质稳定性和配体相互作用。

这些发现为理解两种重要病原体的物种特异性生存策略提供了新的视角。牛分枝杆菌能够感染多种动物宿主，而结核分枝杆菌主要感染人类，这种宿主偏好性差异可能与其分子调控机制的细微差别有关。VapBC3相互作用的稳定性差异可能影响细菌在应激条件下的适应能力，进而影响其致病策略。

该研究的启示意义在于，靶向TA系统可能成为对抗耐药分枝杆菌感染的新策略。通过干扰VapBC3介导的细菌生存通路，有可能破坏细菌的休眠状态，增强抗生素效果。然而，作者也谨慎指出，这些结论目前仍基于生物信息学预测，需要后续实验验证确认其生物学意义。未来研究应聚焦于这一突变对VapC3介导应激反应的具体影响，以及针对VapBC3通路的治疗应用开发。

这项发表于《Scientific Reports》的研究不仅深化了对分枝杆菌TA系统功能多样性的理解，也为针对细菌持久性机制的抗菌药物开发提供了新的理论基础。在抗生素耐药性日益严峻的背景下，此类基础研究对于开辟新的抗感染治疗途径具有重要价值。