人胚胎干细胞向心肌细胞分化的动态蛋白质组学图谱揭示铁死亡与Sirtuin信号在心脏发育中的关键作用

《Scientific Reports》：Dynamic proteome profiling of differentiating human embryonic stem cells towards cardiomyocytes

本研究针对心脏发育早期分子机制不清、阶段特异性标志物缺乏等问题，通过TMT标记定量蛋白质组学技术，系统解析了人胚胎干细胞（hESC）向心肌细胞分化过程中五个关键阶段（hESC、ME、CME、CPC、C）的蛋白质动态变化。研究发现心脏中胚层（CME）阶段富集铁死亡相关通路，而心肌细胞成熟阶段激活Sirtuin信号调控代谢重编程，并筛选出包括ANPEP、SHISA2、TNNT2等在内的阶段特异性蛋白标志物。该研究为心脏发育机制提供了新见解，并为心肌再生治疗的细胞纯度控制提供了潜在靶点。

　　

心脏作为人体第一个发挥功能的器官，其发育过程中的分子机制至今尚未完全阐明。尤其令人遗憾的是，心肌细胞在成熟后基本丧失再生能力，一旦因心肌梗死等疾病造成大量死亡，只能通过心脏移植进行治疗。人多能干细胞（hPSC）因其无限增殖和分化为心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞的潜能，成为心脏再生医学的理想种子细胞。尽管研究人员已建立了高效的体外心肌分化体系，但对分化早期阶段——如中胚层（ME）和心脏中胚层（CME）——的蛋白质组动态变化知之甚少，这限制了对心脏发育全过程的理解，也阻碍了获得高纯度功能细胞用于治疗。

为了填补这一空白，研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新成果，他们对人胚胎干细胞系Royan H6（RH6）向心肌细胞分化的五个关键时间点（第0天hESC、第1天ME、第3天CME、第6天CPC、第12天心肌细胞）进行了深入的定量蛋白质组学分析。研究发现，心脏中胚层分化阶段可能通过激活铁死亡（Ferroptosis）来推动细胞命运决定，而心肌细胞成熟则依赖于Sirtuin信号通路介导的代谢重塑。该研究不仅揭示了心脏发育的新机制，还鉴定出一系列阶段特异性蛋白标志物，为获得高纯度心肌细胞群体用于疾病建模、药物筛选和细胞治疗奠定了基础。

研究人员主要运用了以下关键技术：利用动态悬浮培养体系进行人胚胎干细胞的心肌定向分化；通过基于串联质量标签（TMT）的定量蛋白质组学技术，结合高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（nanoLC/ESI-MS/MS）对四个生物学重复样本进行深度蛋白质鉴定与定量；借助生物信息学工具（如聚类分析、IPA通路富集、GO分析）对差异表达蛋白进行功能阐释；并采用Western blotting对关键蛋白表达进行验证。

蛋白质组学分析揭示了心肌细胞分化过程中的蛋白质类别和生物学过程

通过对四个生物学重复的深度蛋白质组学分析，共鉴定出6279种蛋白质，其中4417种在不同分化阶段存在显著差异表达。主成分分析（PCA）显示，五个分化阶段的样本能够清晰区分，但hESC（第0天）和ME（第1天）的蛋白表达谱较为接近，提示多能性退出与中胚层分化初期存在一定的分子连续性。基于PANTHER系统的分类显示，这些蛋白质可归为23类，主要参与代谢物互变、核酸代谢、蛋白修饰等19种生物学过程。无监督聚类分析将差异表达蛋白分为6个主要簇，每个簇对应不同的表达动态和功能富集。例如，簇4（467种蛋白）从多能性到心肌细胞阶段呈线性上调，功能富集于蛋白质包装、翻译后修饰、运输以及细胞骨架重组，反映了细胞为适应特化命运而进行的结构重塑。相反，簇2（487种蛋白）表达量线性下降，功能与DNA复制和细胞增殖密切相关，表明分化过程伴随着从增殖向功能特化的转变。

潜在生物标志物的鉴定为每个分化阶段提供特异性标识

通过将每个阶段与其他四个阶段进行两两比较，研究人员鉴定出37个hESC特异性、11个ME特异性、9个CME特异性、4个CPC特异性和212个心肌细胞（C）特异性的差异表达蛋白。这些标志物中，既有已知的经典标记物，如hESC阶段的PODXL、ME阶段的EOMES和MIXL1、CME阶段的PDGFRA和ANPEP（CD13）、CPC阶段的SHISA2和SCD5，以及心肌细胞阶段的TNNT2、MYH6等，也包含大量此前未报道的潜在新标志物。例如，ME阶段特异性蛋白EPHA2和SLC7A5可能参与上皮-间质转化（EMT）和Wnt信号调控；CME阶段的CADM1和HVCN1是膜蛋白，有望用于CME细胞群体的分选富集。这些阶段特异性蛋白的发现，为精确识别、追踪和纯化心脏谱系发育过程中的特定细胞群体提供了宝贵的分子资源。

过渡阶段特异性蛋白（TSPs）调控hESC向心肌细胞的逐步分化

通过比较相邻分化阶段，研究人员发现，从ME到CME的转变涉及325个TSPs，是变化最剧烈的过渡期。从hESC到ME的过渡中，FGF2、DNMT3B等多能性相关蛋白下调，而EOMES、MIXL1等中胚层关键转录因子上调。从ME到CME的过渡中，氨基酸转运体SLC3A2/SLC7A5下调，提示细胞从增殖状态转向命运决定；同时，纤维连接蛋白FN1、整合素ITGA5等细胞外基质和粘附分子上调，与心脏形态发生密切相关。从CME到CPC的过渡中，钙处理蛋白RYR2、ATP2A2（SERCA2）和收缩蛋白TTN开始上调，为心肌收缩功能做准备，而TCF4等Wnt信号成分下调，符合CPC阶段需要抑制Wnt以促进心脏特化的已知规律。从CPC到心肌细胞的过渡中，大量与肌节结构（如ACTN2、TNNT2、MYH6）、细胞连接（CDH2）、脂肪酸氧化（HADHB、ACADS）和氧化磷酸化（ETC复合物亚基）相关的蛋白显著上调，标志着成熟心肌细胞收缩装置和能量代谢系统的建立。

铁死亡可能在心脏中胚层分化中被激活

通路富集分析显示，在ME向CME分化的过程中，铁死亡通路被显著富集。研究人员观察到多个促进铁死亡敏感性的分子事件：自噬受体SQSTM1下调，可能导致抗氧化核心转录因子NRF2的稳定性降低；铁蛋白重链和轻链（FTH1、FTL）下调，可能增加细胞内游离Fe²⁺水平；氨基酸转运体SLC3A2（系统xc^-轻链）下调，可能影响谷胱甘肽（GSH）的合成；同时，ATM激酶和MAP1B上调，可能通过干扰铁代谢和促进铁蛋白自噬（ferritinophagy）加剧氧化应激。此外，脂肪酸合成酶（FASN）上调和脂滴蛋白PLIN2下调，可能共同导致脂质过氧化水平升高。这些变化共同营造了一个易于发生铁死亡的细胞环境。研究者推测，这种受控的氧化应激可能并非引发细胞死亡，而是作为一种分化信号，类似于其在免疫细胞分化中的作用，驱动细胞从多能状态向心脏中胚层命运转变。

Sirtuin信号在CPC向心肌细胞转化过程中被激活

在CPC向心肌细胞（第12天）分化过程中，线粒体去乙酰化酶SIRT3的表达显著上调。SIRT3是线粒体功能的关键调控因子，其大量靶蛋白在成熟心肌细胞中同样富集，包括脂肪酸β-氧化中的HADHB、ACAT1，三羧酸循环中的IDH2、MDH2，以及电子传递链（ETC）中的多个复合物亚基（如NDUFA9、SDHB、ATP5PO）。这表明SIRT3可能通过去乙酰化修饰激活这些代谢酶，驱动心肌细胞的代谢重编程，从早期的糖酵解转变为以脂肪酸氧化和氧化磷酸化为主的成熟能量代谢模式，以满足其极高的能量需求。SIRT3信号的激活，是心肌细胞获得成熟功能特征的重要标志。

本研究通过动态蛋白质组学分析，揭示了人胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的关键分子开关。研究发现，心脏中胚层特化可能与铁死亡通路相关，而心肌细胞成熟则依赖于Sirtuin信号通路介导的代谢重塑。此外，研究还筛选出大量阶段特异性蛋白标志物，为深入理解心脏发育机制、优化体外心肌分化方案、以及未来在再生医学中获取高纯度功能细胞提供了重要的数据资源和理论依据。这些发现将推动心脏生理学和病理学研究进入一个新的信息维度。