基于双环滚环扩增与CRISPR/Cas12a的可编程无非特异性遗传分析系统：一种高灵敏度、高保真度的p53基因检测新策略

《Scientific Reports》：Programmable no-nonspecific genetic analytical system via dual-circle-based rolling circle amplification with an efficient CRISPR/Cas12a biosensing strategy

本研究针对核酸扩增技术中存在的非特异性放大难题，创新性地开发了一种NEase辅助靶标循环（NATR）触发的无非特异性指数滚环扩增（NER）反应与CRISPR/Cas12a系统联用的检测平台。该研究通过设计含NEase识别位点的双环状单链DNA探针，实现了p53基因的超灵敏（检测限0.77 fM）和高特异性（可识别单碱基错配）检测，在血清样本中与qPCR结果高度一致，为资源有限地区的癌症早期筛查提供了低成本、高可靠性的解决方案。

　　

在癌症早期筛查的征途上，科学家们始终在追寻一把能够精准捕捉微量肿瘤DNA的"分子探针"。p53基因作为最重要的抑癌基因，其突变与半数人类癌症的发生发展密切相关。然而，传统检测方法如实时定量聚合酶链反应（qPCR）和DNA测序虽性能可靠，却受限于精密仪器、复杂操作和高昂成本，在资源匮乏地区难以普及。更令人困扰的是，当前主流的等温核酸扩增技术（NAA）如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA），常因引物间相互作用引发非特异性扩增，导致假阳性结果，严重制约了检测的可靠性。

面对这一挑战，陆军军医大学第二附属医院张利群教授团队在《Scientific Reports》上发表了一项突破性研究。他们巧妙地将切口内切酶（NEase）介导的指数滚环扩增（RCA）与CRISPR/Cas12a系统相结合，开发了一套名为NATR-NER/Cas12a的新型生物传感策略。该系统的核心创新在于设计了两条带有NEase识别位点的环状单链DNA（ssDNA），分别作为预引物和扩增模板。只有当目标p53基因存在时，切口内切酶Nt.BstNBI才会将环状预引物切割成线性片段，触发后续的指数级扩增反应。这种"双环锁钥"的设计从源头上杜绝了非特异性扩增的可能，犹如为分子检测装上了一把"智能安全锁"。

关键技术方法

研究团队通过三步反应实现检测：首先利用Nt.BstNBI实现靶标循环切割，随后通过phi29 DNA聚合酶和Nt.BbvCI介导的指数RCA反应扩增信号，最后通过CRISPR/Cas12a系统特异性识别并产生荧光信号。实验优化了关键酶浓度、反应时间等参数，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证反应可行性，并利用8例临床血清样本与qPCR进行对比验证。

可行性验证

凝胶电泳结果清晰展示了该系统的精妙设计：只有当p53靶标存在时，Nt.BstNBI才能将环状预引物切割成线性片段（图1A lane 7），而单独的环状预引物或靶标均无法引发切割（图1A lane 4-6）。更重要的是，切割产生的线性引物能够特异性与环状模板杂交（图1A lane 9），为后续扩增奠定基础。在指数RCA阶段，Nt.BbvCI的引入使得扩增产物被切割成不同长度的片段（图1B lane 1），显著提高了扩增效率。荧光实验进一步证实，CRISPR/Cas12a系统能够特异性识别RCA产生的短ssDNA片段，产生强烈的荧光信号（图1C），而对照组几乎无背景信号（图1D）。

参数优化

研究团队对六个关键参数进行了系统优化（图2）。最终确定的最佳条件为：Nt.BstNBI浓度3 U、靶标循环时间1 h、模板浓度10 nM、phi29 DNA聚合酶2 U、Nt.BbvCI浓度2 U，以及Cas12a与crRNA浓度比1.5:1。这些优化确保了系统在最佳性能下运行。

分析性能评估

性能评估揭示了Nt.BbvCI的关键作用。无Nt.BbvCI时，系统检测限为0.56 pM（图3），而引入Nt.BbvCI后，检测灵敏度显著提升至0.77 fM（图4），提高了近三个数量级。该系统在10 fM-1 nM范围内呈现良好线性关系，凸显了指数扩增的巨大优势。这种卓越的灵敏度得益于三重放大效应：靶标循环切割、指数RCA扩增和CRISPR/Cas12a信号转换。

特异性、重复性与稳定性

特异性实验显示（图5A-B），系统对完全匹配的p53靶标产生强烈信号，而对单碱基错配（MT1）、双碱基错配（MT2）、三碱基错配（MT3）及其他干扰核酸（miRNA-21、EGFR 19del、Kras等）均无显著响应，展现了卓越的区分能力。重复性（RSD=2.90%）和稳定性（RSD=4.69%）测试结果（图5C-D）表明系统具有良好的重现性和可靠性，满足临床检测需求。

实际应用验证

在真实样本验证中（图6），研究人员在10%稀释人血清中进行加标回收实验，回收率达92.08%-102.62%。更重要的是，对8例临床血清样本的检测结果与qPCR高度一致（R²=0.999），证明该方法在复杂生物基质中仍保持优异性能。

这项研究成功构建了一种革命性的核酸检测平台，通过巧妙的"双环设计"从根本上解决了等温扩增中非特异性放大的难题。与传统方法相比，该技术不仅将检测时间缩短了1.5小时，灵敏度提高了26倍，更将单样本检测成本控制在约0.8美元。这种兼具高灵敏度、高特异性和低成本特点的检测策略，为癌症早期诊断、预后评估及个性化治疗提供了新的技术支撑，特别是在医疗资源有限的基层医院和偏远地区展现出巨大的应用前景。该研究为分子诊断领域的发展开辟了新的方向，标志着高保真核酸检测技术向临床实用化迈出了关键一步。