基于酪氨酸酶定点偶联的工程化铁蛋白纳米颗粒抗原展示平台研究

《Scientific Reports》：Site-directed tyrosinase conjugation on engineered ferritin retains immune recognition

本研究针对铁蛋白(Ft)纳米颗粒抗原展示技术中遗传融合方法的局限性，开发了一种基于酪氨酸酶(tyrosinase)介导催化的模块化生物偶联新策略。研究人员通过定点突变在激烈火球菌铁蛋白(PfFt)中引入单一半胱氨酸残点，实现了SARS-CoV-2 RBD和裂谷热病毒Gn抗原的位点特异性共价偶联。结果表明，每个24聚体纳米颗粒可展示多达13个抗原，且偶联产物保持了纳米级结构和抗原免疫原性，与中和抗体的结合亲和力达到纳摩尔水平(2-7 nM)。该平台为下一代蛋白疫苗的开发提供了强有力的技术支撑。

　　

在疫苗研发领域，纳米颗粒平台因其能够模拟病原体的重复抗原排列而备受关注。其中，铁蛋白(ferritin, Ft)纳米颗粒以其良好的稳定性、明确的架构和生物相容性成为理想的抗原展示支架。然而，目前主流的遗传融合策略将抗原直接与铁蛋白融合，存在表达量低、蛋白错误折叠和纳米颗粒组装受损等问题。更关键的是，这种方法仅限于末端融合位点，灵活性和适应性不足。

针对这些挑战，葡萄牙iBET和ITQB NOVA研究所的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究。他们开发了一种基于酪氨酸酶(tyrosinase)介导催化的模块化抗原展示策略，通过蛋白质工程和酶催化技术的结合，实现了抗原在铁蛋白纳米颗粒上的精准、高效偶联。

研究人员选择天然不含半胱氨酸的激烈火球菌铁蛋白(Pyrococcus furiosus ferritin, PfFt)作为支架，通过定点突变引入了三个单一半胱氨酸位点(K8C、D33C和E92C)。这些位点经过精心选择，确保表面可及性并促进重复性抗原展示，同时不影响纳米颗粒的结构完整性。

酪氨酸酶介导的偶联机制巧妙利用了酶催化的特异性：酪氨酸酶将抗原C末端Y标签中的酪氨酸残基氧化为o-醌，后者通过1,6-迈克尔加成反应与铁蛋白上的半胱氨酸硫基形成共价硫醚键。这种方法不仅反应条件温和(生理pH和温度)，而且具有高度的位点特异性。

关键技术方法包括：蛋白质工程(定点突变)、酪氨酸酶介导生物偶联、尺寸排阻色谱纯化、质谱分析(包括肽质量指纹图谱)、动态光散射(DLS)、质量光度法、生物层干涉术(BLI)和负染透射电镜(nsTEM)等表征技术。所有实验均使用世界卫生组织(WHO)优先考虑的临床相关抗原：SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)、裂谷热病毒(RVFV)Gn胞外域和疟疾疫苗靶点PfRipr5片段。

设计并表征Pyrococcus furiosus铁蛋白(PfFt)突变体

研究人员通过生物信息学分析选择了三个表面暴露位点进行突变(K8C、D33C和E92C)，这些位点位于不同的二级结构区域，确保了结构多样性和抗原可及性。结构表征表明，所有突变体都保持了24聚体纳米颗粒结构，分子量约487 kDa，流体动力学直径12-13 nm，与野生型相当，证明突变没有破坏纳米颗粒的完整性。

PfFt纳米颗粒和抗原的硫基含量

Ellman's assay分析显示，K8C和D33C突变体每个单体含有约0.8个可及硫基，E92C含有0.5个，而野生型不含可检测硫基。计算表明，每个24聚体纳米颗粒具有12-19个可及硫基，为高效偶联奠定了基础。重要的是，RBD-Y和Gn-Y抗原中所有半胱氨酸都参与二硫键形成，避免了非特异性反应。

抗原与PfFt纳米颗粒的酪氨酸酶介导偶联

在最佳反应条件下，每个纳米颗粒平均可偶联13个Gn-Y或11个RBD-Y抗原，偶联效率超过60%，比之前使用人铁蛋白的研究提高了一倍以上。值得注意的是，三种PfFt突变体的偶联效率相当，证明了平台的稳健性。然而，富含半胱氨酸的PfRipr5-Y抗原偶联效果不佳，可能与结构无序和硫基氧化有关。

抗原呈现PfFt纳米颗粒的偶联效率、区域选择性和功能完整性

质谱分析显示，约55%的Gn-Y-PfFt单体和较低比例的RBD-Y-PfFt单体被成功偶联。肽质量指纹图谱虽未直接鉴定出半胱氨酸-酪氨酸交联肽段，但关键肽段的缺失间接证实了共价键的形成。使用无半胱氨酸的野生型PfFt的对照实验进一步证实了偶联的区域选择性。

负染电镜图像中，抗原呈现的纳米颗粒显示出明显的周边密度，特别是较大的Gn抗原更为明显，直观证实了抗原的成功展示。功能分析通过生物层干涉术(BLI)进行，显示偶联的抗原与中和抗体具有纳摩尔级的结合亲和力(2-7 nM)，与可溶性抗原相当，证明偶联过程没有破坏抗原的构象表位。

讨论与结论

这项研究成功建立了一个基于酪氨酸酶介导催化的模块化抗原展示平台。与传统的遗传融合方法相比，该策略具有多个显著优势：首先，模块化组装允许抗原和支架在各自最佳宿主中表达，显著提高了产量(PfFt在大肠杆菌中可达克级产量，而Gn-Y单独表达产量比融合构建体提高50倍)；其次，位点特异性偶联确保了抗原的规整排列，有利于免疫识别；第三，平台灵活性高，可快速适配不同抗原。

与转谷氨酰胺酶(transglutaminase)和分选酶A(sortase A)等其他酶偶联方法相比，酪氨酸酶催化具有独特的优势：Y标签可置于N端或C端，且只需要小标签(GGY)，对抗原结构影响小。该方法特别适合天然不含半胱氨酸的支架和半胱氨酸数量为偶数的抗原伙伴。

研究也指出了平台的优化方向：对于富含半胱氨酸或结构无序的抗原(如PfRipr5-Y)，可考虑使用半胱氨酸封端剂或引入刚性连接子来改善偶联效率。未来还需要通过免疫原性研究验证这些纳米颗粒的实际保护效果。

这项技术不仅适用于疫苗开发，在靶向治疗、诊断试剂等生物技术领域也有广泛应用前景。通过结合蛋白质工程、酶催化和纳米技术，该研究为应对WHO优先疾病(如裂谷热和COVID-19)提供了强有力的技术平台，代表了铁蛋白展示技术的重要进展。