大鼠慢性化脓性中耳炎炎症反应关键基因Has2、Clec5a和Il6的鉴定与机制研究

《Scientific Reports》：Identification and mechanism of key genes in inflammatory response of chronic otitis media in rats

本研究针对慢性化脓性中耳炎(CSOM)炎症反应生物标志物缺乏的现状，通过构建大鼠CSOM模型，结合转录组测序和生物信息学分析，鉴定出Has2、Clec5a和Il6三个关键基因，并证实其在CSOM中显著上调。研究揭示了这些基因通过蛋白酶体通路、脂肪酸代谢等途径参与炎症调控，为CSOM的靶向治疗提供了新思路。

　　

耳朵流脓、听力下降，这可能是慢性化脓性中耳炎(Chronic Suppurative Otitis Media, CSOM)在作祟。全球有3.3亿人深受其扰，这种慢性炎症性疾病不仅导致持续性耳漏、鼓膜穿孔，更是发展中国家儿童永久性听力丧失的主要原因。当前治疗主要依赖长期局部抗生素，但效果有限，耐药性和反复感染问题突出。究其根源，CSOM的炎症反应机制尚未明确，关键调控基因如雾里看花，制约了精准治疗的发展。

在这一背景下，昆明医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科的李欧莱(Oulai Li)、林燕(Yan Lin)等研究人员在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究。他们通过构建大鼠CSOM模型，结合多组学分析，成功揭示了炎症反应的关键调控基因及其作用机制，为开发新的诊疗策略带来了曙光。

研究主要采用了几项关键技术：首先通过铜绿假单胞菌(PAO1)接种SD大鼠建立CSOM模型；利用RNA测序(RNA-seq)技术分析差异表达基因；采用支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)和最小绝对收缩和选择算子(LASSO)算法筛选关键基因；通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)和免疫组化(IHC)进行实验验证；还进行了功能富集分析、药物预测和分子对接等生物信息学分析。

CSOM模型在SD大鼠中的建立

研究人员通过诱导SD大鼠鼓膜穿孔后接种铜绿假单胞菌成功构建CSOM模型。与对照组相比，CSOM组大鼠体重减轻，中耳液细菌载量显著增加，菌落形成单位(CFU)明显升高，证实模型建立成功。

-4)。数据以均值±标准误表示(n=8/组)。采用t检验进行统计分析。*P<0.05 与对照组相比。'>

共获得15个候选基因

转录组样本质量控制合格，主成分分析(PCA)显示无异常样本。共鉴定出351个差异表达基因(DEGs)，其中177个在CSOM样本中表达上调，174个表达下调。与炎症反应相关基因取交集后，获得15个候选基因。

候选基因功能多样性分析

基因本体(GO)富集分析显示候选基因涉及414个生物学过程条目、15个细胞组分条目和25个分子功能条目。京都基因与基因组百科全书(KEGG) Pathway富集分析发现20条显著相关通路。蛋白互作网络(PPI)包含9个节点和17个边，Il6与7个基因形成复杂网络。

机器学习鉴定关键基因

SVM-RFE分析确定4个基因的最优子集，LASSO分析获得6个基因的最优模型。取交集得到Has2、Clec5a和Il6三个关键基因。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示这三个基因的曲线下面积(AUC)值均大于0.7，诊断效能良好。

关键基因表达验证

RNA-seq数据显示三个关键基因在CSOM样本中高表达。RT-qPCR结果验证Has2、Clec5a和Il6在CSOM中显著上调(P<0.05)。免疫组化结果一致显示三个基因的蛋白表达均显著上调。值得注意的是，核苷二磷酸激酶(NDK)蛋白在CSOM组表达显著增加(P<0.0001)。

-ΔΔCt方法定量基因表达，以GAPDH为内参。数据以均值±标准误表示(n=8/组)。采用t检验进行统计分析。(e-g)免疫组化(IHC)验证(e)Has2、(f)Clec5a和(g)Il6蛋白表达。(h)通过IHC分析NDK蛋白表达。采用t检验和GraphPad Prism软件进行统计分析。P<0.05,P<0.01,P<0.001,**P<0.0001 与对照组相比，如方法中所述。'>

列线图构建与通路分析

列线图显示Has2对CSOM影响更显著。校准曲线平均误差为0.022，决策曲线分析(DCA)显示列线图具有更好的净效益，ROC曲线的AUC值为1，预测准确性高。基因集富集分析(GSEA)发现关键基因参与多种生物学过程，Clec5a和Il6富集于蛋白酶体通路，Clec5a和Has2参与丙酸代谢、脂肪酸代谢等通路。

调控网络与药物预测

Has2被鉴定为15个miRNA的靶标。药物-基因相互作用分析发现12种药物可能与IL6基因相关。分子对接显示穿心莲内酯、地马匹莫、泊拉普锌、VX-702与IL6具有良好的结合相互作用，结合能<-6 kcal/mol。

研究结论表明，Has2作为透明质酸合成关键酶，通过产生不同分子量透明质酸片段在炎症中发挥双重作用；Clec5a作为模式识别受体，通过与TLR2协同增强对细菌感染的免疫应答；IL6作为经典炎症因子，在CSOM患者中耳分泌物中显著升高，与疾病严重程度正相关。这三个关键基因主要通过调控蛋白酶体通路、Fcγ受体介导的吞噬作用、脂肪酸代谢等过程参与CSOM的发病机制。

该研究的重大意义在于首次系统鉴定了CSOM炎症反应中的三个关键调控基因，并深入揭示了其分子机制。不仅为CSOM的早期诊断提供了潜在的生物标志物，而且通过药物预测和分子对接分析，为开发靶向治疗策略奠定了理论基础。特别是NDK蛋白在CSOM中的高表达，为理解炎症反应与疾病发生提供了新视角。这些发现对改善CSOM临床治疗效果、开发新的治疗药物具有重要指导价值，为未来精准医疗在耳科疾病中的应用开辟了新途径。