解耦Shaker钾通道揭示的孔道关闭态结构及其对严格耦合Kv1通道门控机制的重构

《Nature Communications》：Closed state structure of the pore revealed by uncoupled Shaker K+ channel

本研究针对严格耦合型电压门控钾通道(Kv1)关闭态结构未知的难题，通过构建解耦突变体I384R，利用单颗粒冷冻电镜技术首次解析了Shaker钾通道的关闭态结构。研究发现孔道区S6螺旋通过“滚动-转动”复合运动实现关闭，选择性滤器呈现非经典构象，并揭示了由I384、Y485、E395等残基组成的三方相互作用口袋在机电耦合中的核心作用。该成果发表于《Nature Communications》，为理解严格耦合Kv通道的门控机制提供了全新结构基础。

　　

电压门控钾通道(Kv)是调控细胞兴奋性、免疫应答等生理过程的关键蛋白，也是重要的药物靶点。尽管近年来结构生物学取得显著进展，但严格耦合型Kv1通道家族（如Shaker通道）的关闭态结构始终未能破解。这类通道的特点是电压感受域(VSD)与孔道域(PD)之间存在强制性耦联：孔道的开放或关闭必须分别伴随电压感受器的激活或失活。这种严格耦合虽然能确保静息状态下极低的钾离子漏流，却也给解析门控机制带来巨大挑战——在零膜电位条件下，电压感受器通常处于激活态，而孔道域则呈现开放构象。

为突破这一瓶颈，研究人员聚焦于Shaker钾通道S4-S5连接器中的保守异亮氨酸I384。通过系统突变筛选发现，将该位点替换为精氨酸(I384R)可完全解耦电压感受器与孔道域：在-120mV至+180mV电压范围内，孔道始终保持关闭，而电压感受器却能独立激活。这种独特的电生理特性使I384R成为解析孔道关闭态的理想研究对象。

研究团队综合运用单通道记录、门控电流测量、电压钳荧光显微术等技术证实I384R突变体的解耦特性后，采用单颗粒冷冻电镜解析了其3.5?分辨率结构。结构分析显示，与开放态相比，关闭态孔道区发生显著构象重排：S6螺旋沿其全长发生平移和旋转运动，使疏水残基I470和V474直接阻塞渗透途径，最小孔径小于1?。

选择性滤器(SF)呈现出非经典构象：G446位点的羰基翻转离开渗透路径，导致仅存在S2和S4两个钾离子结合位点，与经典的四离子线性排列模式截然不同。此外，电压感受器被捕获在激活但未松弛状态，S4-S5连接器向孔道方向发生4.1?的横向位移，形成更紧密的环状结构。

分子相互作用分析揭示了一个关键的三方作用口袋：在野生型通道中，I384嵌入由F484和Y485形成的疏水口袋，而Y485的羟基与相邻亚基的R394、E395相互作用，形成VSD与PD间的耦联基础。在I384R突变体中，精氨酸侧链跳出疏水口袋，与相邻亚基的E395形成盐桥，破坏原有相互作用网络，从而实现机电解耦。

关键技术方法包括：非洲爪蟾卵母细胞表达系统进行电生理记录，单颗粒冷冻电镜解析I384R突变体结构，电压钳荧光显微术监测局部构象变化，非平稳噪声分析评估单通道特性，以及琥珀密码子抑制技术实现荧光非天然氨基酸(ANAP)的特定位点嵌入。

保守异亮氨酸控制Kv1家族的机电耦合

系统突变扫描发现S4-S5连接器中的I384是调控耦联强度的关键位点。取代为较小残基（如I384C）会增强耦联强度，而替换为谷氨酸、天冬酰胺酸或亮氨酸则导致严重解耦。其中I384R突变完全消除离子传导，仅保留门控电流，且QV曲线左移，表明电压感受器运动能耗降低。

完全解耦突变体揭示的关闭态结构

冷冻电镜结构显示I384R孔道呈完全关闭状态。与开放态相比，S6螺旋发生旋转和平移复合运动，使I470和V474形成两个收缩点。荧光非天然氨基酸ANAP在470位的实时监测证实该区域在通道开放过程中发生构象变化。

电压感受器捕获于激活但未松弛状态

尽管所有电压感受器均处于激活态，但长时间去极化未能诱导松弛态转变，表明I384R中的VSD处于非松弛状态。结构比较发现S4-S5连接器发生显著侧向位移，这可能阻碍了松弛态的形成。

选择性滤器的非经典构象和蛋白体积变化

关闭态中选择性滤器仅结合两个钾离子（S2和S4位点），G446羰基翻转导致S1位点破坏。跨膜区蛋白截面面积计算显示开放态比关闭态扩大近10%，这种体积变化可能是Kv通道机械敏感性的结构基础。

研究结论挑战了基于原核通道建立的经典铰链门控模型，提出严格耦合Kv通道的"滚动-转动"新机制：S6螺旋通过多步骤复合运动实现孔道开放，同时该运动通过变构效应调控选择性滤器构象。三方相互作用口袋的发现揭示了机电耦合的结构基础，而孔道体积的电压依赖性变化为理解通道机械敏感性提供了新视角。这些发现不仅深化了对电压门控离子通道工作机制的认识，也为相关疾病治疗和药物设计提供了重要结构依据。