靶向FcγRI的创新型抗体C01与C04通过特异性阻断免疫复合物结合抑制自身免疫反应的临床前研究

《Nature Communications》：Preclinical assessment of two FcγRI-specific antibodies that competitively inhibit immune complex-FcγRI binding to suppress autoimmune responses

本研究针对FcγRI（Fc gamma receptor I）过度激活在多种自身免疫性疾病中的关键作用，开发了两种新型FcγRI特异性阻断抗体C01和C04。通过噬菌体展示技术筛选获得的高亲和力抗体能有效竞争性抑制90%的IgG和免疫复合物（IC）与FcγRI结合，并能置换60%已结合的IC。在类风湿关节炎（RA）和免疫性血小板减少症（ITP）患者来源的模型中，这两种抗体显著抑制自身抗体-IC与单核细胞、巨噬细胞和活化中性粒细胞的结合，并在人源化小鼠模型中证实其治疗潜力。该研究为开发FcγRI靶向疗法提供了重要依据。

　　

在自身免疫疾病的复杂发病机制中，免疫系统的异常激活始终是科研人员关注的焦点。特别是被称为FcγRI（Fc gamma receptor I）的高亲和力IgG Fc受体，它在免疫复合物（IC）介导的炎症反应中扮演着“双刃剑”的角色。正常情况下，FcγRI被循环中的IgG饱和，像一个需要被跨越的激活阈值。然而，当多价免疫复合物出现时，它们能有效置换单体IgG，引起受体簇聚，进而通过与其关联的FcRγ链上的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）启动下游信号传导。这一过程导致抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和促炎细胞因子的释放，当IC沉积在器官中时，便会引发慢性炎症。

FcγRI的过度激活与多种自身免疫疾病密切相关，包括系统性红斑狼疮（SLE）、免疫性血小板减少症（ITP）和类风湿关节炎（RA）。在RA中，针对瓜氨酸化蛋白的自身抗体（ACPA）形成的IC会与FcγRI结合，驱动关节炎症和骨破坏。值得注意的是，RA特异性自身抗体还能直接结合破骨前体细胞上的FcγRI，诱导其分化为成熟的活性破骨细胞，可能导致骨吸收增加。此外，FcγRI也在神经元上表达，包括与痛觉相关的背根神经节（DRG）神经元。RA特异性自身抗体激活DRG神经元可能是患者感到疼痛的原因之一。因此，抑制FcγRI的过度激活有望成为治疗自身免疫疾病的新策略。

然而，现有的商业化抗FcγRI抗体（如克隆10.1、197、m22和H22）存在明显局限。它们主要通过Fc段与FcγRI相互作用来阻断配体结合（即Kurlander效应），而非通过Fab片段特异性结合配体结合域，因此阻断效率有限，且存在激活受体的风险，可能加剧炎症反应。此前，H22（MDX-33）在临床I/II期试验中因副作用而中止，凸显了开发不激活FcγRI的高效阻断抗体的迫切性。

为了突破这些限制，研究团队采用了一种创新的策略——噬菌体展示文库筛选技术。该技术能通过遗传工程改造噬菌体，使其表面表达抗体的单链可变片段（scFv），从而完全规避Fc段与FcγRI的相互作用。通过多轮抗原引导的筛选和噬菌体扩增，研究人员能够特异性靶向FcγRI的配体结合域，即其第二个胞外结构域（EC2）。FcγRI由三个胞外结构域（EC1-EC3）、跨膜区和胞内尾部构成。其中EC2与其他Fcγ受体同源，但其FG环存在一个单氨基酸缺失，这一特征与其高亲和力结合特性相关。

本研究旨在对通过此方法获得的新型抗FcγRI抗体进行临床前表征，评估其配体阻断能力及治疗潜力，并利用患者来源的IC进行功能验证。

研究人员为开展本研究应用了几个关键技术方法：利用噬菌体展示文库筛选并制备了七种靶向FcγRI的Fc沉默（L234A/L235A/P329G突变）人源IgG1抗体；通过流式细胞术系统评估了抗体与FcγRI的结合特性、阻断配体（单体IgG和IC）结合及置换已结合配体的能力；利用X射线晶体学解析了C01 Fab片段与FcγRI胞外段（EC1-3）的复合物结构；采用LigandTracer技术定量分析了抗体与FcγRI的结合动力学（亲和力KD）；通过钙流和超氧化物爆发实验检测了抗体是否引发FcγRI激活；建立了基于RA患者来源的ACPA-IC和ITP患者外周血单核细胞（PBMC）的体外疾病模型，以及人源化免疫缺陷NSG-FcRy^-/-小鼠的体内ITP模型，用于评估抗体的治疗效

表征C01和C04揭示其特异性结合FcγRI的EC2域且不导致激活

系统发育分析显示，新抗体panel（C01-C16）与商业化抗体（10.1, 611, H22）的V_H和V_L序列源自不同的共同祖先。结合实验表明，C01和C04在IVIg（静脉注射免疫球蛋白）存在下无法结合FcγRI，而其他克隆和10.1则不受影响，提示C01/C04与IgG共享结合表位。结构域交换实验证实，C01和C04像hlgG1一样，主要结合人FcγRI的EC2域。X射线晶体结构分析揭示了C01-FcγRI复合物的精细结构：C01通过其重链CDR1-3和轻链CDR1、CDR3与FcγRI的EC2域相互作用，埋藏面积达1278 ?2。C01的表位包含FcγRI EC2上的17个残基，其中14个与IgG Fc的结合位点重叠。尤为重要的是，C01的结合诱导FcγRI发生构象变化，导致对Fc结合至关重要的疏水口袋部分塌陷，从而通过空间位阻和结合竞争双重机制抑制Fc结合。C01和C04对FcγRIIa/b和FcγRIIIa/b无结合，显示出对FcγRI的高特异性。亲和力测定显示C01（K_D = 1.21 × 10^-10 M）和C04（K_D = 5.43 × 10^-10 M）的亲和力高于hlgG1（K_D = 1.19 × 10^-9 M）和10.1（K_D = 2.19 × 10^-8 M）。功能实验证实，C01和C04本身不引起钙动员或超氧化物爆发，甚至能有效抑制m22抗体交叉连接所引发的FcγRI激活。

C01和C04在阻断hlgG和IC与FcγRI结合方面优于10.1

配体阻断实验表明，C01和C04能有效抑制90%的单体hlgG与FcγRI结合，显著优于其他克隆和10.1（仅抑制约40%）。即使将其制备成F(ab')₂片段，阻断效果依然保持，证实了其Fab介导的阻断机制而非Fc段的立体阻碍。在可溶性IC阻断实验中，C01和C04能将IC结合降低至3.3-16.5%（C01）和9.6-31.5%（C04），而10.1处理下仍有高达44.5%的IC能够结合。使用IgG包被的磁珠模拟IC的玫瑰花结实验进一步验证了C01和C04的强大阻断能力，它们能平均减少46-61%的玫瑰花结形成，且呈浓度依赖性。

C01和C04能在37°C下置换已结合的hlgG和IC

为了模拟自身免疫疾病中IC已预先结合于免疫细胞FcγRI的实际情况，研究人员评估了抗体置换已结合配体的能力。在存在过量hlgG的条件下，C01和C04在4小时内能置换约45%的预结合hlgG，并在20小时内达到约60%的置换率（hlgG和IC）。而10.1不仅不能有效置换，反而轻微增加了hlgG的结合。在更接近生理条件的实验中，将抗体与预先包被了人血清IgG的单核细胞或中性粒细胞共培养过夜，C01和C04能成功结合到细胞表面，证明了其在生理环境下有效的置换能力。

两种新型抗体能有效抑制RA患者来源的自身抗体与单核细胞、巨噬细胞和活化中性粒细胞的结合

在RA体外模型中，C01和C04能显著抑制重组单克隆ACPA-IC（mACPA-IC）与健康供者单核细胞的结合（阻断率约72%），且效果优于10.1。在由单核细胞分化而来的巨噬细胞上，C01和C04也能强力阻断mACPA-IC结合（阻断率约63-69%），而10.1几乎无效。值得注意的是，用G-CSF和IFN-γ刺激中性粒细胞可诱导其FcγRI表达显著上调，而不影响FcγRII和FcγRIII的表达水平。在这种模拟RA炎症环境的活化中性粒细胞上，C01和C04能浓度依赖性地抑制mACPA-IC和患者来源的多克隆ACPA-IC（pACPA-IC）的结合，最高阻断率可达约70%。而10.1对mACPA-IC的阻断作用微乎其微（约2.5%）。

C01和C04在ITP体外和体内疾病模型中显示出强效抑制作用

在ITP患者来源的PBMC体外模型中，C01和C04能有效抑制调理化血小板与单核细胞的结合，平均抑制率分别约为53%和41%，而10.1的效果不显著。在携带人免疫系统的NSG-FcRy^-/-小鼠ITP模型中，预先给予C01处理的小鼠在注射抗血小板抗体6A6-hlgG1后4小时，其循环血小板残留率高达49.5%，显著高于PBS对照组（29%），证明了C01在体内减轻IgG驱动的血小板清除的能力。

本研究首次详细表征了两种通过Fab片段特异性阻断FcγRI配体结合域的新型抗体C01和C04。晶体结构揭示了其通过竞争性结合EC2域并诱导受体构象变化从而抑制Fc结合的分子机制。功能实验证实它们具有高亲和力、高特异性，能有效阻断和置换IgG及IC，且不激活FcγRI。在RA和ITP的疾病相关模型中，C01和C04展现出显著的治疗潜力。相较于以往主要通过Fc段发挥阻断作用的抗体，C01和C04避免了激活受体的风险，具有更好的安全性。该研究不仅为理解FcγRI生物学功能提供了新工具，也为开发治疗自身免疫疾病、神经病理性疼痛甚至由IgG4自身抗体介导的疾病的新型疗法奠定了坚实的基础。未来通过亲和力成熟等技术进一步优化抗体特性，有望推动其向临床转化，造福广大患者。