一种模仿degron的分子粘合剂促进了CRBN的同源二聚化及其降解过程

《Nature Communications》：A degron-mimicking molecular glue drives CRBN homo-dimerization and degradation

CRBN降解剂MRT-31619通过形成同源二聚体模拟G-loop去泛素化结构域，诱导CRBN泛素化降解，并验证其高选择性和无钩效应，为靶向E3连接酶提供新工具。

　　CRBN（Cereblon）是一种广泛应用于靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）的E3泛素连接酶。在这一研究中，科学家们报告了一种名为MRT-31619的分子胶黏剂降解剂（Molecular Glue Degrader, MGD），它能够驱动CRBN的同源二聚化，并通过泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）实现其快速、高效且特异的降解。这一发现为理解MGD的作用机制、探索其内源性底物以及揭示其在生理过程中的功能提供了重要的工具。

CRBN最初与大脑生物学相关，但近年来的研究表明，它在维持细胞稳态中发挥着关键作用，并推动了TPD在临床应用中的发展。TPD技术主要依赖于如分子胶黏剂降解剂（MGDs）或蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）等化合物。这些化合物通常通过与CRL4^CRBN泛素连接酶复合物结合，招募新的底物进行泛素化和降解。CRBN的PROTACs是一类异双功能分子，由两个共价连接的配体组成，一个用于与新的底物结合，另一个则与CRBN结合，通过连接子将二者连接。相比之下，CRBN的MGDs是一种较小的分子，能够直接与CRBN结合并改变其表面结构，使其能够识别新的底物。最初的CRBN-MGD复合物被发现可以与底物的G-loop结构域相互作用，这种结构域是蛋白表面的一个重要特征。这些MGD-蛋白-底物的三元复合物通常通过化合物-蛋白和蛋白-蛋白之间的相互作用得以稳定。最近的研究表明，MGD结合的CRBN可能能够识别除G-loop以外的其他结构域，这表明CRBN的新型底物范围可能比之前认为的更广泛。

MRT-31619的发现是这一领域的重大进展。它能够以一种独特的方式促进CRBN的同源二聚化，并通过模拟G-loop结构域来形成三元复合物，从而驱动CRBN的降解。研究中通过比较MRT-31619与已知的CRBN同源PROTAC（如OUN20985）发现，尽管两者在与CRBN的二元亲和力上相似，但MRT-31619在降解效率、选择性和速度方面表现出色。尤其是在1?μM浓度下，MRT-31619在1小时和24小时后仍然保持高度的降解能力，而CRBN同源PROTAC则在高浓度下出现“钩效应”（hook effect），即随着化合物浓度的增加，降解效率反而下降。这种现象在传统的PROTAC中较为常见，因为高浓度的PROTAC会占据双侧的结合位点，从而阻止三元复合物的形成。然而，MRT-31619没有表现出这种效应，表明其作用机制与传统的PROTAC有所不同。此外，MRT-31619在1?μM和10?μM浓度下表现出良好的选择性，而许多已知的CRBN新型底物（如ZFP91、ZNF692、ZNF653、RNF166、IKZF1等）则会被CRBN同源PROTAC降解，进一步说明MRT-31619在特异性方面具有优势。值得注意的是，MRT-31619并没有导致DDB1的降解，这表明其作用机制主要集中在CRBN本身，而不是其他蛋白。

为了验证MRT-31619是否能够促进CRBN的同源二聚化，研究人员采用了一种名为NanoBRET的生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）技术。该技术通过将HaloTag标记的CRBN与NanoLuc标记的CRBN进行相互作用，从而检测其二聚化情况。实验结果显示，MRT-31619确实能够促进CRBN的二聚化，而与lenalidomide竞争后，这种二聚化作用显著减弱。这一结果表明，MRT-31619与CRBN的结合依赖于特定的结构域，即CRBN的三色氨酸（tri-tryptophan）口袋。为了进一步验证这一点，研究人员使用了CRBN的W386A突变体，并发现该突变体在MRT-31619处理下完全失去了CRBN的二聚化能力。这说明三色氨酸口袋在MRT-31619诱导的CRBN二聚化过程中起着关键作用。

为了深入理解MRT-31619如何促进CRBN的降解，研究团队采用了单颗粒冷冻电镜（Cryo-EM）技术，以确定CRBN同源二聚体的结构基础。通过纯化的CRBN-DDB1^?BPB（DDB1缺失β-propeller结构域）与MRT-31619结合，研究人员获得了两个分辨率为2.9??和3.1??的结构图。这两个结构代表了CRBN在不同构象下的主要形式，其中一种构象由于局部灵活性未能被完全解析。在其中一个结构中，研究人员观察到MRT-31619分子在CRBN的三色氨酸口袋中形成了一种类似螺旋的结构，桥接了两个CRBN亚基。这种螺旋状的二聚结构被稳定的疏水相互作用所维持，特别是通过其螺旋连接子区域的相互作用。此外，MRT-31619还通过非经典的C–H···O芳香氢键与另一个CRBN分子相互作用，这种相互作用进一步加强了二聚体的结构稳定性。这些协同作用不仅解释了MRT-31619如何诱导CRBN的二聚化，也展示了其在药物设计中的潜力，即通过构象控制和分子识别的结合来优化药物的结构。

在结构分析的基础上，研究人员进一步探讨了MRT-31619如何模拟G-loop结构域。在Cryo-EM结构中，MRT-31619的苯甲酰基团与CRBN的W400侧链的吲哚氮形成氢键，这与CRBN-CK1α-lenalidomide结构中CK1α的G-loop结构域与CRBN的相互作用类似。通过将CRBN-CRBN结构与CRBN-CK1α-lenalidomide结构进行比对，研究人员发现MRT-31619在结构上与CK1α的G-loop结构域非常相似，从而能够模拟其与CRBN的相互作用。为了验证这一假设，研究团队合成了一系列MRT-31619的结构类似物，并评估了它们的活性。其中，MRT-31015通过将MRT-31619的末端苯基替换为乙酰基团，导致其对CRBN的降解能力减弱；而MRT-30568虽然保留了芳香性，但缺乏形成关键氢键所需的羰基，因此完全失去了降解活性。这些结果表明，MRT-31619的结构对于其与CRBN的相互作用至关重要，尤其是其羰基与W400侧链的氢键，这可能是其高选择性和高效性的关键所在。

此外，研究团队还通过全球泛素化组学分析，进一步揭示了MRT-31619如何诱导CRBN的泛素化。实验发现，MRT-31619处理后，CRBN的多个赖氨酸残基被显著泛素化，尤其是K211、K300、K222和K166。这些泛素化位点位于CRBN的DDB1结合区域附近，这表明CRBN的泛素化可能与DDB1的结合有关。然而，尽管DDB1的一些赖氨酸残基也被泛素化，但这些修饰并未导致DDB1的降解，这可能是因为DDB1的结合位点对于泛素转移不够理想，或者CRBN在泛素化后会阻碍DDB1的结合。此外，研究团队还提出了其他可能的解释，例如E3/E2动态和蛋白比例等因素，这些因素可能影响DDB1的降解。尽管具体的机制尚不明确，但这些数据为未来研究UPS的动态行为提供了重要的模型。

MRT-31619的发现不仅揭示了其独特的结构和作用机制，还展示了其在细胞生物学研究中的应用潜力。作为一款化学敲除工具，MRT-31619可以用于研究CRBN在不同细胞类型中的功能，特别是在评估其他分子胶黏剂降解剂对CRBN的依赖性方面。相比于传统的遗传方法，MRT-31619具有许多优势，例如其能够轻松应用于多种细胞和组织类型、具有快速和可逆的特点。此外，MRT-31619可能比现有的CRBN靶向PROTAC更具优势，因为它能够实现快速、高效和特异的CRBN降解，而不需要依赖其他E3连接酶的活性。这些特性使得MRT-31619成为一种极具前景的化学探针，有助于揭示CRBN在多种生理过程和疾病中的作用。

研究还发现，MRT-31619能够诱导CRBN的同源二聚化，这种二聚化可能通过一种独特的复合界面实现，该界面由化合物-化合物、蛋白-蛋白和化合物-跨蛋白相互作用共同驱动。这种二聚化机制与传统的PROTAC不同，后者通常需要两个不同的配体来形成三元复合物。MRT-31619通过模拟G-loop结构域，使CRBN自身成为新的底物，从而实现了自我降解。这一发现不仅重新定义了CRBN作为E3连接酶和新型底物的双重角色，还拓展了分子胶黏剂识别机制的概念。这种自我靶向的机制为未来设计具有类似功能的化合物提供了新的思路，即通过诱导蛋白-蛋白同源二聚化来调节生物学通路。

总体而言，MRT-31619作为一种新型的分子胶黏剂降解剂，展示了其在靶向蛋白降解领域的巨大潜力。它不仅能够高效、特异地降解CRBN，还能够通过诱导其同源二聚化来模拟G-loop结构域，从而促进其自身的降解。这一发现为理解分子胶黏剂的作用机制提供了新的视角，并为开发更有效的靶向蛋白降解工具奠定了基础。此外，MRT-31619的应用不仅限于基础研究，还可能在疾病治疗中发挥重要作用，特别是在神经退行性疾病的研究中。由于CRBN在维持细胞稳态中的关键作用，MRT-31619能够作为研究CRBN内源性底物和其在人类神经退行性模型中的功能的有力工具。未来，随着对CRBN及其新型底物的进一步研究，MRT-31619有望成为一种重要的药物开发平台，为精准医疗提供新的可能性。