环状单链DNA增强非病毒基因插入在造血干细胞和祖细胞中的效率及其治疗潜力

《Nature Communications》：Circular single stranded DNA potentiates non-viral gene insertion in hematopoietic stem and progenitor cells

本研究针对非病毒基因治疗中长片段DNA模板递送效率低的挑战，开发了基于TALEN技术和千碱基级环状单链DNA（CssDNA）的基因编辑策略。研究人员通过对比线性单链DNA（LssDNA）和腺相关病毒（AAV6）载体，发现CssDNA在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中可实现高达49%的基因敲入效率，且编辑后的细胞在NCG小鼠模型中展现出更强的植入能力和基因编辑稳定性。该研究为下一代细胞和基因治疗提供了通用、可扩展的非病毒DNA模板方案。

　　

基因治疗一直是生物医学领域的热点，尤其是基于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的疗法，有望为遗传性疾病提供一次性治愈方案。然而，传统的病毒载体如腺相关病毒（AAV）虽效率较高，却存在免疫原性、插入突变风险以及生产成本高昂等问题。非病毒方法如线性双链DNA（LssDNA）或线性单链DNA（LssDNA）虽安全性更优，但易被细胞内DNA感知通路识别引发毒性，且在HSPCs中的编辑效率较低，限制了其临床应用。因此，开发一种高效、安全的非病毒基因插入技术迫在眉睫。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，由Gil Letort和Aymeric Duclert共同领导的研究团队提出了一种创新解决方案：利用环状单链DNA（CssDNA）作为DNA供体模板，结合TALEN技术，实现高效、精准的基因插入。研究结果表明，CssDNA不仅能显著提升基因敲入效率，还能保持HSPCs的干性和体内植入能力，为下一代基因治疗奠定了坚实基础。

为开展本研究，作者团队采用了多项关键技术方法。实验以健康捐赠者来源的G-CSF动员外周血CD34+ HSPCs和原代T细胞为材料，通过TALEN介导的基因编辑系统，对比了线性单链DNA（LssDNA）、环状单链DNA（CssDNA）和AAV6作为DNA供体模板的效率。研究利用流式细胞术、集落形成单位（CFU） assay、单细胞转录组与表面蛋白测序（CITE-seq）以及NCG小鼠异种移植模型，综合评价了编辑效率、细胞活力、分化能力和长期植入效果。

Circular single-stranded DNA molecules can be used as DNA donor template for efficient TALEN-mediated gene insertion in HSPCs

研究人员首先以B2M基因 exon 1为靶点，设计包含0.6 kb和2.2 kb报告基因的CssDNA和LssDNA模板，通过四天编辑流程（包括两次电转）在HSPCs中进行基因插入。结果显示，CssDNA编辑组的基因敲入（KI）效率高达45.2%，是LssDNA组的5倍，且细胞活力和分化能力未受显著影响。此外，CssDNA组的KI/KO（基因敲除）比率更高，表明其更易通过同源定向修复途径整合入基因组。

Circular ssDNA-mediated gene insertion is applicable to different endogenous Loci

为验证CssDNA技术的普适性，研究团队进一步在AAVS1、CD11b和S100A9等基因位点进行测试。结果表明，CssDNA在不同基因位点均能实现高效编辑（KI效率26%-39%），证明该策略适用于多基因座位的靶向插入。

Circular ssDNA-edited HSPCs efficiently engraft in NCG mice

通过NCG小鼠模型评估编辑后HSPCs的体内功能，发现CssDNA编辑组在移植16周后，人CD45+细胞植入率与AAV6组相当，但KI事件保持率显著更高（14.9% vs 5.5%）。更重要的是，CssDNA编辑组骨髓中KI阳性细胞数量是AAV6组的5倍，表明其长期重建能力更强。

Circular ssDNA is efficiently inserted in LT-HSCe

单细胞CITE-seq分析揭示，CssDNA编辑组中富含长期造血干细胞（LT-HSCe）亚群，其频率是AAV6组的5倍。这些细胞处于更静止的代谢状态，高表达骨髓龛黏附标志物（如CXCR4、CD44和F11R），这可能是其高效植入的分子基础。此外，CssDNA编辑组LT-HSCe中KI事件频率是AAV6组的10倍，且KI/indel比率更均衡，提示CssDNA更利于在原始细胞中实现精准编辑。

Circular ssDNA-mediated gene insertion is applicable to T cells

研究还将CssDNA/TALEN系统应用于原代T细胞编辑，结果显示CssDNA在T细胞中同样能实现高达40%的KI效率，且细胞活力保持在90%以上，证明该技术可扩展至其他细胞治疗领域。

本研究系统评估了环状单链DNA（CssDNA）作为非病毒DNA供体模板在HSPCs基因治疗中的潜力。研究发现，CssDNA不仅能显著提升TALEN介导的基因插入效率（最高达49%），还避免了线性DNA模板的毒性和不稳定性。与传统的AAV6方法相比，CssDNA编辑的HSPCs在体内展现出更强的植入能力和基因编辑稳定性，这与其富集LT-HSCe亚群、维持细胞静止状态及上调黏附分子表达密切相关。此外，该技术在不同基因座位和细胞类型（如T细胞）中均具适用性，且其环状结构可抵抗核酸酶降解，生产流程更易符合GMP标准。这些发现不仅解决了非病毒基因治疗中长片段DNA递送的瓶颈问题，也为开发更安全、高效的下一代细胞治疗产品提供了关键技术支持。未来，通过优化CssDNA的免疫原性（如引入cGAS-STING通路抑制剂），有望进一步推动其走向临床应用。