SynergyLMM：一种用于体内药物组合实验的综合性统计框架与网络工具，提升临床前协同作用评估的严谨性

《Nature Communications》：Improved analysis of in vivo drug combination experiments with a comprehensive statistical framework and web-tool

本文推荐一种名为SynergyLMM的综合性统计建模与实验设计框架，专门用于解决体内药物组合实验缺乏统一、严谨分析方法的问题。该研究通过线性/非线性混合效应模型（LMM）拟合纵向肿瘤生长数据，支持Bliss独立、最高单药活性（HSA）和反应相加性（RA）等多种协同作用参考模型，实现时间依赖的协同/拮抗效应统计评估，并提供模型诊断、统计功效分析和三重药物组合分析功能。研究表明，SynergyLMM可提高临床前药物组合结果的稳健性、统计严谨性和一致性，促进从临床前到临床测试的更快速、更安全转化。

　　

在癌症治疗中，单一疗法常常由于药物耐药性的出现而疗效有限，尤其是对于化疗、靶向治疗和免疫治疗。药物组合疗法通过靶向独立的分子通路，提供了克服单药耐药的有效策略。然而，尽管体外药物协同筛选和评估已有多种工具，针对体内药物组合实验的整合统计分析方法却十分缺乏。体内动物模型，尤其是患者来源异种移植（PDX）小鼠模型，能更好地捕捉肿瘤异质性和模拟临床治疗反应，但其治疗效应存在显著的动物间异质性，这对准确评估治疗反应提出了挑战。目前，临床前癌症研究领域缺乏统一的协同作用量化标准，研究人员使用各种统计和非统计方法，导致结果不一致和潜在的选择偏倚，这可能会负面影响临床前发现向临床转化的成功率。

为了填补这一空白，Rafael Romero-Becerra、Tero Aittokallio及其同事在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果，推出了SynergyLMM——一个用于评估临床前体内研究中药物组合效应的综合建模与设计框架。与其他方法不同，SynergyLMM能够适应复杂的实验设计（包括多药物组合），并通过纵向药物相互作用分析（包括模型诊断和统计功效分析）为协同作用和拮抗作用的统计分析提供实用选项。这些功能使研究人员能够优化研究设计，确定足够数量的动物和随访时间点，以实现充分的协同效应和统计功效。SynergyLMM被实现为一个易于使用的网络应用程序，使得没有编程技能的研究人员也能广泛使用。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法。首先，他们建立了基于指数或Gompertz肿瘤生长动力学的（非线性）混合效应模型（LMM），该模型能有效捕捉个体间异质性和纵向肿瘤生长实验估计的组合效应动态变化。其次，他们开发了基于Bliss独立性、最高单药活性（HSA）和反应相加性（RA）等多种参考模型的协同/拮抗效应统计评估框架，并提供时间分辨的协同评分（SS）和组合指数（CI）估计。此外，该方法还包含模型诊断、异常值识别、统计功效分析（包括事后和事前分析）以及三重药物组合分析功能。研究所用数据来源于已发表的体内实验数据集（涉及不同癌症模型和治疗类别）以及内部进行的动物实验（如4T1乳腺癌模型）。

时间分辨的协同与拮抗效应评估

研究团队重新分析了多个已发表的体内药物组合实验数据，以验证SynergyLMM在时间依赖性评估中的价值。例如，在U87-MG FM胶质母细胞瘤模型中，Docetaxel与GNE-317的组合在HSA模型下显示出显著协同作用，但在Bliss模型下则无足够证据拒绝相加性。相反，在BV-173-Gluc白血病模型中，Imatinib与Dasatinib的组合在HSA模型下显示协同作用，而在Bliss模型下却显示拮抗作用，这突显了选择与所研究药物组合相适应的协同参考模型的重要性。SynergyLMM还能够识别在不同时间点协同效应的变化，例如在CHL-1 FM黑色素瘤模型中，早期时间点观察到显著协同作用，而在后期因测量变异性增加而消失。

SynergyLMM能够识别有影响的个体

除了提供多种模型诊断工具外，SynergyLMM还提供选项来识别实验中对模型拟合有高度影响的个体（动物）。例如，在MDA-MB-231 FM模型的AZD628与Gemcitabine组合实验中，诊断分析识别出对照组中的一个个体对拟合值和对照组生长速率系数的估计有显著影响，其肿瘤生长曲线明显区别于其他动物。这种诊断分析通过识别潜在的异常值、测量误差或具有独特肿瘤生长模式的个体，提高了结论的可靠性。

利用SynergyLMM评估肿瘤相关通路

SynergyLMM的稳健统计框架使其成为评估体内药物组合效应的通用工具。除了验证假设的协同作用外，它还支持探索药物相互作用对分子通路的影响。研究团队重新分析了Gilfillan等人研究的MAS98.06 luminal-like乳腺癌PDX模型数据，该研究假设HER2/HER3信号通路在激素治疗耐药肿瘤中不依赖雌激素受体（ER）活性促进肿瘤生长。SynergyLMM分析证实，Heregulin（HER3激动剂）与Fulvestrant（ER拮抗剂）的组合产生拮抗效应，而EGF（EGFR激动剂）与Fulvestrant的组合则显示出协同效应，这为了解肿瘤生物学提供了新的见解。

SynergyLMM支持三重药物组合效应分析

SynergyLMM扩展了其应用，可用于分析三重药物组合实验。对MAS98.06模型中Heregulin、Fulvestrant和Trastuzumab的三重组合分析表明，其效果与Fulvestrant+Trastuzumab双药组合相似，未发现协同作用的证据，这支持了作者提出的机制：当HER2被Trastuzumab抑制时，Heregulin的拮抗作用会消失。同样，对U87-MG FM模型中Osimertinib、AZD2014和Docetaxel三重组合的重新分析并未证实原始文章使用中位效应原理得出的协同结论，甚至显示出早期时间点存在拮抗趋势。

与其它统计方法的比较

与常用的单时间点t检验相比，SynergyLMM利用所有可用数据估计生长速率，并考虑个体内相关性，克服了简单方法的局限性。与现有的体内协同分析工具（如invivoSyn和CombPDX）相比，SynergyLMM提供了更精确的时间依赖性效应描述、统计显著性评估，并且其独特之处在于能够统计评估拮抗作用（使用双尾检验），而其他方法主要关注协同作用（使用单尾检验）。在模拟研究中，SynergyLMM在存在异常值的情况下表现出更好的稳健性，能最大限度地减少假阴性和假阳性的风险。

SynergyLMM实现统计功效分析以改进实验设计

统计功效是检测药物组合效应的关键决定因素。SynergyLMM提供事后和事前功效分析功能，以帮助优化实验设计。事后功效分析显示，残差和随机效应方差高且组合组生长速率高（效应量低）的模型统计功效较低。事前功效分析表明，可以通过调整样本量、随访时间或测量频率来提高功效。例如，对SW837结肠癌模型的分析表明，需要将每组的样本量增加到14只动物才能达到0.8的统计功效；而对LS-1034模型的分析表明，将随访时间减少到18天并进行7次测量即可达到高于0.8的统计功效。

SynergyLMM结果的稳健性

模拟研究评估了SynergyLMM对模型设定错误和分布假设违反的稳健性。即使在使用指数模型分析模拟的逻辑增长数据（违反某些假设）时，SynergyLMM仍能提供一致的结果，尽管检测的灵敏度和特异性会随着模型假设与观测数据之间差异的增大而受到影响，这凸显了使用适当模型以获得可靠结果的重要性。

综上所述，SynergyLMM通过其综合的统计框架、时间分辨的协同/拮抗评估、模型诊断、功效分析和支持复杂实验设计（包括三重组合）的能力，为临床前体内药物组合实验的分析提供了强大的工具。其易于使用的网络工具形式使得更广泛的研究人员能够应用这些先进方法，有望提高临床前癌症研究的严谨性、可重复性和可解释性，从而促进更可靠、更具转化潜力的药物组合疗法的开发。尽管存在一些局限性（如对特定肿瘤生长模型的依赖、小样本情况下渐近近似的潜在问题等），但SynergyLMM在多种实验设置中的成功应用展示了其推动癌症组合疗法发现的巨大潜力。