实验性噬菌体进化拓展宿主范围以靶向抗生素耐药肺炎克雷伯菌的研究

《Nature Communications》：Experimental phage evolution results in expanded host ranges against antibiotic resistant Klebsiella pneumoniae isolates

本研究针对日益严重的抗生素耐药性危机，特别是ESKAPEE病原体中的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)多重耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)问题，通过实验进化技术对噬菌体进行30天共培养训练，成功获得宿主范围显著扩展的进化噬菌体。这些噬菌体在固体和液体培养基中均能有效抑制临床分离株生长，基因组分析显示其突变主要集中于尾部纤维蛋白区域。该研究为应对抗生素耐药性提供了新的治疗策略。

　　

在全球公共卫生领域，抗生素耐药性正以前所未有的速度蔓延，其中ESKAPEE病原体（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌属和大肠杆菌）的耐药问题尤为突出。这些微生物通过获得质粒介导的耐药机制，对包括β-内酰胺类在内的多种抗生素产生耐药性，使得临床治疗面临严峻挑战。肺炎克雷伯菌作为ESKAPEE病原体中的重要成员，不仅具有极高的耐药性发展倾向，还能产生黏液样外层结构，进一步增加治疗难度。

面对这一危机，研究人员将目光投向了一种已有百年历史但曾被抗生素取代的治疗方案——噬菌体疗法。噬菌体是能够特异性感染并裂解细菌的病毒，对人类宿主相对安全。然而，传统噬菌体疗法存在宿主范围有限、细菌易产生快速耐药性等局限性。为突破这些瓶颈，由Pooja Ghatbale等研究人员组成的团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，通过实验进化技术成功培育出宿主范围显著扩展的噬菌体，为对抗耐药菌感染提供了新思路。

本研究采用的关键技术方法包括：从美国大陆不同环境样本中分离天然噬菌体；通过透射电子显微镜(TEM)进行形态学鉴定；利用Illumina平台进行全基因组测序；采用30天连续共培养体系进行噬菌体-细菌实验进化；通过斑点法和液体生长曲线法评估宿主范围及抑菌效果；基于BV-BRC平台进行基因组变异分析。所有临床菌株均来源于UC San Diego Health患者样本。

研究结果

噬菌体分离与鉴定

研究人员从环境样本中分离到11个独特的噬菌体，分属4个不同的系统发育分支。基因组大小范围为37.9 Kbp至177.7 Kbp，通过透射电子显微镜鉴定包含肌尾病毒科、短尾病毒科和长尾病毒科等多种形态类型。

宿主范围评估

对59株临床肺炎克雷伯菌分离株的宿主范围测试显示，部分噬菌体如LK3、LK2和Chai几乎无裂解活性，而KL35、Tumeric、Rec等噬菌体则表现出不同程度的裂解能力。39株携带超广谱β-内酰胺酶(ESBL)或其它耐药基因的菌株中，包括5株碳青霉烯耐药肠杆菌(CRE)。

实验进化设计

研究团队建立了为期30天的噬菌体-细菌共进化体系，每日转移1%的共培养物至新鲜培养基，每3天测定噬菌体斑形成单位(PFU)和菌落形成单位(CFU)。该实验设计特别考虑了临床分离株的黏液表型与实验室适应菌株的差异。

宿主范围扩展

选择具有中等宿主范围的噬菌体Ace和APV进行进化实验。进化后噬菌体APV的裂解活性从27.12%提升至最高61.02%，噬菌体Ace从42.37%提升至59.32%。进化噬菌体获得了对原始无法裂解的肺炎克雷伯菌分支的感染能力，包括新的O抗原和荚膜血清型。

生长动力学评估

在72小时液体培养实验中，进化噬菌体在10/12例中表现出比原始噬菌体更优的细菌生长抑制能力。通过曲线下面积(AUC)分析，58%的案例显示统计学显著的生长抑制效果。

MDR和XDR菌株抑制

进化噬菌体对多重耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株均表现出更强的抑制能力，75%的菌株在72小时内被显著抑制，包括碳青霉烯耐药肠杆菌(CRE)分离株。

噬菌体遗传变异

全基因组分析显示，进化噬菌体Ace的平均核苷酸一致性超过99.99%，而APV为99.98%。突变主要集中于尾部纤维蛋白和基板区域，这些区域与宿主识别和吸附密切相关。L型尾部纤维蛋白中发现的非同义突变可能是表型改变的主要分子基础。

讨论与结论

本研究成功证实了实验进化策略在扩展噬菌体宿主范围方面的有效性。通过30天的共进化训练，噬菌体不仅获得了对更广泛临床分离株的裂解能力，还显著提升了对耐药菌株的长期抑制效果。遗传学分析表明，尾部纤维蛋白区域的适应性突变是表型改进的主要分子机制。

该研究的创新性在于将实验室验证的进化策略成功应用于临床耐药菌株，为个性化噬菌体疗法的开发提供了技术框架。相比传统抗生素，进化噬菌体具有靶向性强、不易产生交叉耐药等优势。特别是对产KPC酶(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)的广泛耐药菌株的有效抑制，展现了其在应对极端耐药情况下的应用潜力。

尽管本研究聚焦于肺炎克雷伯菌，但类似的实验进化策略可推广至其他ESKAPEE病原体，为全面应对抗生素耐药性危机提供了新范式。随着噬菌体药理动力学研究的深入和临床试验的推进，这种基于进化原理的精准抗菌策略有望成为后抗生素时代的重要治疗手段。