HepG2细胞多组学样本制备策略优化：单相与双相提取方法的系统比较与性能评估

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Optimizing multiomics sample preparation: comparative evaluation of extraction protocols for HepG2 cells

本研究针对多组学研究中样本制备方法选择缺乏系统评估的问题，系统比较了单相磁珠法和双相MTBE法在HepG2细胞中同步提取代谢物、脂质和蛋白质的性能。研究发现单相提取结合400 nm磁珠和60分钟快速酶切方案在重现性、操作效率和成本效益方面表现最优，为肝毒性研究模型提供了标准化的多组学样本制备方案。

　　

在当今系统生物学时代，科学家们越来越意识到单一组学研究的局限性。就像盲人摸象一样，只关注基因组、转录组、蛋白组或代谢组中的某一个层面，很难全面理解复杂的生命活动规律。多组学整合分析应运而生，它能够同时捕捉多个分子层面的信息，揭示它们之间的相互作用网络。然而，要实现真正意义上的多组学分析，一个关键挑战是如何从同一样本中高质量地提取不同类型的分子，从而避免由于样本间生物学变异导致的数据不一致性。

HepG2细胞系作为肝脏毒理学研究和药物代谢研究的重要模型，在生物医学研究中应用广泛。但针对该细胞系的多组学研究，样本制备方法的选择往往依赖于经验而非系统评估。目前主流的多组学样本制备方法主要包括两类：基于甲基叔丁基醚(MTBE)的双相提取法，以及基于有机溶剂和磁珠的单相提取法。这两种方法各有优劣，但它们在HepG2细胞这一特定模型中的性能表现尚未得到充分比较。

正是在这一背景下，德国萨尔大学实验与临床毒理学与药理学系的Tilman F. Arnst研究团队在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。该研究系统比较了两种成熟的多组学样本制备方案在HepG2细胞中的应用效果：一种是传统的双相MTBE提取法，该方法通过相分离分别获得代谢物和脂质，然后对中间相蛋白质沉淀进行过夜酶切；另一种是新兴的单相提取法，该方法利用磁珠同步提取代谢物、脂质和蛋白质，并实现加速酶切。

研究人员采用了一套先进的分析技术组合：代谢组学样本使用液相色谱-高分辨串联质谱(LC-HRMS/MS)进行分析，而脂质组学和蛋白质组学样本则通过纳流液相色谱-离子迁移谱-高分辨串联质谱(nano-LC-IMS-HRMS/MS)进行分析。这种技术组合充分利用了不同质谱平台的优势，为全面评估样本制备方法的性能提供了可靠的数据基础。

研究团队从总特征数、选择性、重现性、操作复杂度和整体性能等多个维度对每种方法进行了系统评估。他们不仅比较了两种基本方法，还对单相提取法进行了深入优化，系统研究了磁珠尺寸（400 nm和700 nm）和酶切条件（40分钟、60分钟、90分钟快速酶切和过夜酶切）对结果的影响。

在代谢组学分析中，研究人员发现使用400 nm磁珠的单相提取法(ME 400)表现最佳，在正负离子模式下分别检测到745±10和221±2个特征，显著高于其他方法。重现性评估显示，ME 400方法的特征变异系数(CV)中位数为21%，明显优于双相MTBE法的31%。通过SIRIUS软件进行化合物分类预测，ME 400方法检测到的有机酸及其衍生物(OAD)数量也最多（141个），表明其对极性代谢物具有更好的提取效率。

脂质组学分析却呈现出不同的趋势。双相MTBE法在正离子模式下检测到6483±84个特征，负离子模式下检测到446±3个特征，均高于单相提取法。重现性方面，MTBE法的特征CV中位数为19%，也优于单相法的22-23%。化合物分类分析显示，MTBE法检测到的脂质和类脂分子(LLLS)数量达到1591个，且脂质类别分布（脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂等）与单相法相当，表明其对脂质分子具有更好的提取广度和重现性。

蛋白质组学分析结果显示，双相MTBE法结合过夜酶切鉴定到的蛋白质数量最多（5224±232个），而单相提取法中，使用700 nm磁珠的40分钟快速酶切法(ME 700_40)表现最佳（4765±182个）。值得注意的是，将酶切时间从40分钟延长至60分钟或90分钟，并未显著提高蛋白质鉴定数量，但将酶与蛋白质比例从1:10降低至1:25也不影响结果，表明快速酶切方案具有较好的稳定性。序列覆盖度和 missed cleavage 率分析显示，过夜酶切方案虽然 missed cleavage 率较低（约88%的肽段完全酶切），但鉴定到的蛋白质数量反而较少，这可能与长时间酶切导致的肽段损失有关。

综合三个组学层面的评估结果，研究人员发现没有一种方法在所有指标上都表现最优。双相MTBE法在脂质组学和蛋白质组学分析中表现优异，但操作复杂、耗时较长；单相提取法在代谢组学分析中表现更好，且操作简便、快速。考虑到多组学研究的实际需求，研究人员最终推荐使用400 nm磁珠结合60分钟快速酶切（酶与蛋白质比例1:25）的单相提取方案作为HepG2细胞多组学研究的最佳选择。

这项研究的创新之处在于它不仅比较了不同提取方法的性能，还针对单相提取法进行了系统优化，建立了适合HepG2细胞的多组学样本制备标准流程。同时，研究还展示了纳流液相色谱-离子迁移谱-高分辨质谱技术在多组学研究中的应用价值，特别是其提供的离子迁移维度信息有助于提高化合物鉴定的准确性。

研究的局限性包括代谢组学分析仅使用了亲水相互作用色谱(HILIC)而未能结合反相色谱，这可能会影响对某些非极性代谢物的检测覆盖度。此外，由于技术限制，纳流液相色谱目前尚未应用于代谢组学分析，未来随着纳米HILIC技术的发展，有望进一步提高代谢组学分析的灵敏度。

这项研究为多组学样本制备方法的选择提供了科学依据，建立的优化方案不仅适用于HepG2细胞，也可为其他细胞模型的多组学研究提供参考。通过平衡方法性能与操作效率，研究人员为肝毒性机制研究、药物代谢评价等领域的多组学研究提供了可靠的技术支持，推动了系统毒理学和精准医学研究的发展。