具有良好HuH-7抑制活性的新型化合物作为新的癌症药物候选物：N,N′-二苯脲与1,2,3-三唑连接的衍生物

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Novel compounds with promising HuH-7 inhibitory activity as new cancer drug candidates: derivatives of N,N′-diphenylurea linked with 1,2,3-triazole

靶向抗癌药物的开发与评估。本研究设计并合成了新型1,2,3-三唑-urea杂交化合物（15个类似物），通过铜催化环加成等高效方法制备，发现化合物3c和3g对肝癌HuH-7细胞展现出最低IC50值（10.8±0.14和11.62±3.72 μM），显著诱导细胞凋亡、DNA损伤及自噬，动物实验证实其安全性。

　　### 研究背景与意义

癌症是全球范围内严重的健康问题之一，每年新增病例和死亡人数都在不断攀升。根据最新统计数据，2022年全球约有2000万例新发癌症病例，其中970万例因癌症相关疾病而死亡。尽管近年来在药物研发方面取得了显著进展，但癌症的发病率和死亡率仍在持续上升。预计到2050年，全球癌症新发病例将增加3500万例，这与职业压力、生活方式改变以及环境因素密切相关。这一严峻的形势强调了开发创新抗癌药物的迫切需求，同时也为药物化学研究带来了重大挑战。随着对癌症分子机制的深入理解，靶向治疗逐渐成为治疗晚期肝细胞癌（HCC）的重要手段。

肝细胞癌（HCC）是肝脏最常见的恶性肿瘤，涵盖原发性和转移性肝癌。在中国，HCC的发病率和死亡率尤为突出，2018年的流行病学数据显示，HCC的年发病率约为17.7/10万，死亡率约为16.4/10万。这些数据表明，HCC不仅对个人健康构成威胁，也给公共卫生系统带来了沉重负担。目前，晚期HCC的治疗主要依赖于分子靶向药物，如索拉非尼（sorafenib）。然而，现有药物在临床应用中常常受到耐药性问题的限制，这促使科学家们寻找具有不同作用机制的新药物。

分子杂交方法已被广泛应用于抗癌药物的开发，这种方法通过将不同生物活性物质的药效团整合，创造出具有增强靶向性和治疗效果的新型化合物。在这一背景下，1,2,3-三唑基结构因其在药物化学中的广泛应用而备受关注。三唑环通常通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）合成，不仅作为药效团，还能作为连接不同药效基团的桥梁。三唑类化合物具有良好的生物相容性、选择性靶向能力和较低的细胞毒性，能够通过细胞周期阻滞和细胞凋亡诱导等机制抑制癌细胞增殖。特别是那些能够发挥双重或多重抗癌作用的三唑杂交化合物，展现出更大的应用潜力。

尿素结构在药物化学中也具有重要地位，其两个氨基基团和连接它们的羰基使其成为高度可药化的结构。在药物设计中，引入尿素结构可以提高药物的生物活性、选择性和理化性质。此外，尿素的使用有助于克服代谢稳定性问题，并减少有毒药效团的副作用。因此，将三唑与尿素结构结合，开发具有更优抗癌效果的新型化合物，成为当前药物研发的一个重要方向。

### 研究内容与方法

本研究设计并合成了一个新的三唑核心结构，结合了芳香族尿素基团。通过亲核加成和铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），成功合成了十五种化合物，具有较高的产率。这些化合物被用于评估其潜在的抗癌活性。值得注意的是，化合物3c和3g在HuH-7细胞中的半数抑制浓度（IC50）最低，分别为10.80±0.14 μM和11.62±3.72 μM。进一步研究表明，3c和3g能够诱导细胞凋亡、刺激DNA损伤以及促进自噬作用。此外，急性毒性测试也显示这些化合物具有良好的安全性。这些发现表明，三唑核心的化合物3c和3g可能是HCC治疗的有希望候选药物，并具有进一步制药开发的潜力。

在实验过程中，采用了一系列生物活性评估方法。其中包括细胞活力测定、细胞凋亡分析、DNA损伤检测以及自噬活性分析。细胞活力测定使用了CCK-8试剂盒，通过检测450 nm波长的吸光度来评估细胞存活率。结果表明，化合物3c和3g在HuH-7细胞中表现出较强的抗增殖活性，而在正常肝细胞L02中则显示出较低的毒性。这提示这些化合物可能具有较好的选择性，能够在抑制癌细胞的同时减少对正常细胞的伤害。

为了进一步了解化合物的作用机制，研究人员对细胞凋亡进行了详细分析。通过使用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，并结合流式细胞术进行检测，发现化合物3c和3g在不同浓度下能够显著增加HuH-7细胞的凋亡率。此外，通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blot技术，研究人员检测了与细胞增殖和凋亡相关的基因和蛋白表达变化。结果显示，化合物3c能够显著上调Keap1的表达，而Keap1是调控氧化应激的重要基因。然而，其他与氧化应激相关的基因如Nrf2、Gpx4和TNFα则没有明显变化。此外，化合物3c还能够显著增加磷酸化组蛋白H2AX（p-H2AX）和裂解的聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表达，这进一步支持了其诱导DNA损伤和促进细胞凋亡的作用。

为了验证这些化合物对DNA损伤的刺激作用，研究人员使用了DNA损伤检测试剂盒，并在荧光显微镜下观察细胞。结果表明，化合物3c和3g能够显著增加HuH-7细胞中的DNA损伤，这可能是其诱导细胞死亡的重要机制之一。此外，自噬活性的检测使用了单丹参酮（MDC）探针，该探针能够特异性地标记自噬体并发出绿色荧光。结果显示，化合物3c和3g在不同浓度下能够显著增加HuH-7细胞中的自噬水平，这表明这些化合物可能通过诱导自噬来实现抗癌效果。

为了确保化合物的安全性，研究人员还进行了急性毒性测试。在实验过程中，选择了SPF级的昆明小鼠作为研究对象，并按照“3R”原则（减少、替代、优化）进行实验设计，以最大程度地减少对动物的伤害和不适。实验结果表明，化合物3c在14天的观察期内未引起任何死亡或毒性表现，其对小鼠体重、外观以及关键器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的重量和组织学检查均未显示出明显的毒性变化。这表明化合物3c在体内具有良好的安全性，为其进一步的药理学研究提供了支持。

### 研究成果与讨论

在化学合成方面，研究人员设计了一种简单、高效的合成路线，成功合成了包含三唑结构和尿素基团的新型化合物。三类不同的连接基团（对位苯基、间位苯基和甲基）被用于连接尿素和三唑单元，这些化合物的合成路线如图2所示。通过“一锅法”合成叠氮侧链，并使用铜催化的点击化学反应连接到炔烃基团，得到了目标产物，产率在85%至96%之间。所有目标化合物均通过核磁共振光谱（NMR）和高分辨率质谱（HRMS）进行结构确认，并且其纯度通过半制备HPLC进一步优化。

在生物学研究方面，化合物3c和3g在HuH-7细胞中表现出显著的抗增殖活性。CCK-8实验结果显示，这两种化合物在50 μM浓度下处理72小时后，细胞活力均低于15%。相比之下，其他化合物如5a–5d和7a–7d的IC50值均高于50 μM，这表明化合物3c和3g在抗HCC活性方面具有明显优势。此外，化合物3c和3g在不同浓度下均能显著诱导细胞凋亡，且其作用呈现剂量依赖性。通过流式细胞术分析，发现处理后的细胞中凋亡细胞比例显著增加，尤其是晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI?）的比例明显上升。

在分子机制研究方面，化合物3c和3g的作用可能涉及多种信号通路。通过RT-PCR和Western blot分析，研究人员发现化合物3c能够显著上调Keap1的表达，而Keap1是调控氧化应激的关键基因。然而，其他与氧化应激相关的基因如Nrf2、Gpx4和TNFα则没有显著变化。这表明化合物3c可能主要通过影响Keap1的表达来调节细胞内的氧化应激水平。此外，化合物3c还能够显著增加p-H2AX和PARP的表达，这些蛋白的增加通常与DNA损伤和细胞凋亡相关。相比之下，化合物3g对DNA损伤相关基因H2AX的表达有抑制作用，但对氧化应激和自噬相关基因的影响较小。这表明两种化合物可能通过不同的机制实现抗癌效果。

进一步研究发现，化合物3c和3g能够显著刺激HuH-7细胞中的DNA损伤。通过DNA损伤检测试剂盒，研究人员观察到处理后的细胞中DNA损伤显著增加，并呈现绿色荧光。这表明化合物3c和3g可能通过干扰DNA修复机制，导致DNA损伤积累，从而诱导细胞死亡。此外，自噬活性的检测也显示，这两种化合物能够显著增加自噬水平，这可能与其诱导细胞凋亡和DNA损伤的机制有关。

在体内安全性评估方面，研究人员通过急性毒性实验进一步验证了化合物3c的安全性。实验结果显示，化合物3c在14天的观察期内未引起任何死亡或毒性表现，且其对小鼠体重和器官重量的影响均未显著偏离对照组。组织学检查显示，化合物3c处理后的关键器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）未出现明显的病理变化。这些结果进一步支持了化合物3c在体内具有良好的安全性，为其进一步的药理学研究和临床应用提供了依据。

### 研究结论

本研究成功合成了一个新的三唑-尿素杂交化合物系列，并评估了其抗癌潜力。结果表明，三唑核心的化合物，尤其是3c和3g，对HuH-7细胞表现出显著的抑制活性，其效果优于其他癌细胞系。流式细胞术分析显示，这两种化合物能够通过剂量依赖性方式诱导HuH-7细胞的凋亡。分子机制研究表明，这些化合物可能通过调控与DNA损伤、细胞凋亡和自噬相关的信号通路实现抗癌效果。此外，急性毒性实验表明，化合物3c在体内具有良好的安全性，未表现出明显的毒性。

这些发现为靶向治疗HCC提供了新的药物候选分子。化合物3c和3g表现出良好的药物样性质和治疗潜力，值得进一步研究其在体内的抗癌效果和作用机制。未来，研究人员可以继续探索这些化合物在动物模型中的治疗效果，并评估其在临床前研究中的应用前景。此外，进一步的药理学研究可能有助于优化这些化合物的结构，提高其治疗效果和选择性，从而为HCC患者提供更安全、有效的治疗方案。