1,3-二氧-N-苯基异吲哚-5-羧酰胺衍生物的设计、合成与评价：作为高效可逆的人类单胺氧化酶B抑制剂，并具有神经保护作用

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Design, synthesis, and evaluation of 1, 3-dioxo-N-phenylisoindoline-5-carboxamide derivatives as potent reversible inhibitors of human monoamine oxidase B with neuroprotective properties

本研究设计并合成了1,3-二氧基-N-苯基isoindoline-5-羧酰胺系列衍生物，评估其作为人单胺氧化酶B（hMAO-B）抑制剂的活性。通过结构-活性关系（SAR）分析，发现引入3-溴和4-氟的化合物16号具有最高抑制活性（IC50=0.011 μM）和选择性指数（SI>3636），表现为可逆性混合型抑制。分子对接显示其与hMAO-B的相互作用优于现有药物。此外，化合物16号显著抑制脂多糖（LPS）诱导的BV-2细胞中NO和TNF-α释放，并表现出抗氧化活性，提示其作为神经退行性疾病治疗潜在候选药物的价值。

　　这项研究聚焦于开发一系列具有高效抑制作用和神经保护能力的新型人单胺氧化酶B（hMAO-B）抑制剂，旨在为治疗神经退行性疾病提供潜在的药物候选。研究通过设计、合成和评估1,3-二氧六环-N-苯基异吲哚啉-5-酰胺衍生物，发现了其中最有效的化合物16，其表现出显著的hMAO-B抑制活性（IC50值为0.011 μM）以及对hMAO-A的高选择性（选择性指数超过3636）。这些发现为未来的药物研发提供了重要的线索。

### 单胺氧化酶（MAO）的背景

单胺氧化酶是一种线粒体结合的酶，广泛存在于神经元和非神经元组织中。它能够催化多种外源性和内源性单胺的氧化脱氨反应，从而在神经递质代谢中扮演重要角色。hMAO-B是这一酶的两个亚型之一，其在脑部疾病如帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）患者的脑组织中表达和活性显著升高。这种异常的活动可能引发一系列病理变化，包括氧化应激、神经递质耗竭、脂质过氧化、线粒体损伤、神经元凋亡和神经炎症，这些因素被认为是神经退行性疾病发展的关键。

目前，针对hMAO-B的抑制剂已被用于PD的治疗，例如selegiline、rasagiline和safinamide。然而，传统不可逆抑制剂可能会带来安全问题，如酶-抑制剂复合物的免疫原性、不良的药代动力学特性和长期作用可能引发的永久失活。相比之下，可逆抑制剂在长期治疗中表现更佳，且具有更宽的安全窗口。因此，开发新的可逆hMAO-B抑制剂成为研究的重点。

### 化合物设计与合成

研究团队基于已知的hMAO-B抑制剂结构，如phthalimide（其IC50为134 μM），设计了一类新的1,3-二氧六环-N-苯基异吲哚啉-5-酰胺衍生物。他们发现，通过在phthalimide的C5位置引入合适的取代基，可以显著提高其抑制活性。例如，化合物5b在C5位带有5-苯乙氧基取代基，表现出比phthalimide高3116倍的抑制活性（IC50为0.043 μM）。此外，团队还发现N-苯基酰胺基团在设计hMAO-B抑制剂时具有重要作用，例如化合物1a表现出7.66 μM的IC50值。

基于这些发现，研究团队提出了一个新的设计策略，即通过将phthalimide的C5位置替换为N-苯基酰胺基团，以期开发出更有效的hMAO-B抑制剂。他们通过一系列合成步骤，成功制备了24种化合物，包括1-24号化合物。这些化合物的合成通常涉及三聚酸酐（a）与氯化铵（NH4Cl）在二甲基甲酰胺（DMF）中反应，生成中间体（b），然后与相应的芳胺在EDCI和DMAP的存在下进行偶联反应，得到最终产物。

### 生物活性评估

为了评估这些化合物的hMAO-B和hMAO-A抑制活性，研究团队采用了一种基于荧光的体外检测方法。在测试中，所有化合物的hMAO-B抑制率均在1 μM浓度下进行测定，而hMAO-A则在40 μM浓度下进行测定。实验结果显示，化合物16在hMAO-B抑制方面表现最为突出，IC50值为0.011 μM，其对hMAO-A的抑制率则显著较低，选择性指数超过3636。这一结果表明，化合物16具有高度的选择性，这在hMAO-B抑制剂的开发中是重要的优势。

此外，研究团队还通过酶动力学分析进一步确认了化合物16的作用机制。结果显示，该化合物是一种混合型、可逆的hMAO-B抑制剂。这种作用方式意味着其既可能影响酶的活性部位，也可能与酶的其他部位发生相互作用，从而产生抑制效果。与不可逆抑制剂相比，这种作用方式有助于减少潜在的毒副作用，提高药物的安全性。

### 分子对接研究

为了进一步理解化合物16与hMAO-B之间的相互作用机制，研究团队进行了分子对接分析。通过MOE软件，他们模拟了化合物16在hMAO-B活性位点的结合方式。结果显示，化合物16的二氧六环结构占据了酶的底物腔，并且其N-苯基环与酶的入口腔紧密结合。这种结构能够通过氢键和疏水相互作用与酶的活性部位发生有效结合。同时，分子对接还揭示了化合物16在hMAO-B和hMAO-A中的结合差异，其在hMAO-A中的结合自由能明显高于hMAO-B，这可能与其在hMAO-B中表现出更高选择性有关。

### 抗氧化与抗炎活性

除了对hMAO-B的抑制作用，研究还评估了化合物16的抗氧化和抗炎活性。在细胞实验中，化合物16被用于检测其对活性氧（ROS）的清除能力。实验结果显示，化合物16能够有效抑制TBHP诱导的SH-SY5Y细胞中的ROS生成。随着浓度的增加，ROS水平逐渐下降，这表明化合物16具有显著的自由基清除能力。

此外，研究还评估了化合物16对LPS刺激的BV-2小鼠小胶质细胞中一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）释放的影响。结果表明，化合物16能够显著减少这些炎症因子的产生，其抑制效果呈现剂量依赖性。与阳性对照curcumin相比，化合物16在不同浓度下均表现出良好的抗炎活性。这表明化合物16不仅具有高效的hMAO-B抑制能力，还可能在减轻神经炎症方面发挥作用。

### 细胞毒性研究

为了确保化合物的安全性，研究团队还评估了化合物16对BV-2和SH-SY5Y细胞的毒性。通过MTT实验，他们发现化合物16在1至20 μM的浓度范围内对两种细胞均无显著的细胞毒性，这表明其具有较低的毒性风险。这一结果进一步支持了化合物16作为新型hMAO-B抑制剂的潜力。

### 未来研究方向

尽管研究取得了显著成果，但仍有两个方面需要进一步探索。首先，化合物16对hMAO-B的具体抑制机制尚不明确，未来的研究可以通过晶体学技术来解析其与酶的相互作用细节。其次，化合物的药代动力学特性，如CYP450抑制能力和血浆稳定性，仍需在体内实验中进行评估，以确定其是否具备临床应用的潜力。

### 结论

本研究成功开发了一系列新型1,3-二氧六环-N-苯基异吲哚啉-5-酰胺衍生物，其中化合物16表现出最高的hMAO-B抑制活性和显著的选择性。该化合物不仅能够有效减少神经炎症因子的产生，还显示出良好的抗氧化能力，这为治疗神经退行性疾病提供了新的研究方向。研究结果表明，化合物16可能成为进一步开发的有前景的候选药物，具有广泛的应用潜力。未来的研究应继续深入探讨其作用机制，并评估其在体内的药代动力学和安全性，以推动其向临床应用的发展。