从传统的半胱氨酸蛋白酶抑制剂收藏中发现了能够抑制冠状病毒Mpro酶的苄基氨基甲酸酯类抑制剂

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Discovery of benzyl carbamate inhibitors of coronavirus Mpro enzymes from a legacy collection of cysteine protease inhibitors

从针对锥虫蛋白酶的 legacy化合物库中筛选出新型SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）抑制剂，其中化合物1a、5a和5b对Mpro展现出纳米摩尔级抑制活性，通过时间依赖性实验和计算模拟证实其共价可逆抑制机制，并发现对hCatL的特异性抑制。研究为重新挖掘 legacy化合物开发抗冠状病毒新药提供了依据。

　　本研究聚焦于应对SARS-CoV-2病毒的持续变异和抗药性问题，通过筛查一批原本设计用于靶向一种寄生虫酶——克鲁扎因（cruzain）的141种小分子抑制剂，发现了可能用于开发新抗病毒药物的潜在候选化合物。这些化合物不仅显示出对SARS-CoV-2的主要蛋白酶（M^pro）的抑制活性，还对其他冠状病毒如SARS和MERS的M^pro具有类似作用。值得注意的是，这些化合物中没有显示出对SARS-CoV-2的另一种关键蛋白酶——类胰蛋白酶样蛋白酶（PL^pro）的显著抑制效果，这为抗病毒药物的开发提供了新的方向。

M^pro在SARS-CoV-2的复制过程中扮演着至关重要的角色，而PL^pro则负责调节病毒蛋白的加工。因此，针对这两种酶的抑制剂设计对于控制病毒传播具有重要意义。研究发现，其中五个化合物（1a–5a）能够有效抑制M^pro，其抑制效果从0.1601到16.42微摩尔不等，而对PL^pro则无明显作用。这表明这些化合物可能在PL^pro中缺乏合适的结合位点，或者其化学结构与PL^pro的结合特性不匹配。

进一步的实验表明，化合物^1a和^5a，以及其(R,S)构型的^5b，均显示出对SARS-CoV-2、SARS和MERS的M^pro的高效抑制作用。特别是^5b，在抑制SARS-CoV-2 M^pro时表现出最低的IC₅₀值，表明其在结合亲和力和抑制效率方面优于其他候选化合物。这表明，这些化合物可能通过特定的化学结构特征，如苯甲基氨基甲酸（benzyl carbamate）基团和乙烯酮（vinyl ketone）作为攻击头，实现了高效的结合。

除了对M^pro的抑制作用，研究还发现，部分化合物对人组织蛋白酶L（hCatL）也具有一定的抑制效果。hCatL在病毒进入宿主细胞的过程中起到重要作用，因此，对hCatL的抑制可能成为另一种抗病毒策略。然而，^5a和^5b未显示出对hCatL的抑制作用，这可能是由于它们的结合位点和化学结构与hCatL存在差异，导致无法有效结合或作用。

研究中还通过非共价和共价分子对接、分子动力学（MD）模拟以及密度泛函理论（DFT）计算，进一步验证了这些化合物的作用机制。结果表明，这些化合物可能通过形成共价键与M^pro的半胱氨酸活性中心结合，从而实现长期抑制。然而，MD模拟和DFT计算也显示，这些化合物可能具有可逆的共价结合特性，即在一定条件下可以解离，这与实验观察到的可逆抑制效果相一致。此外，通过分析不同冠状病毒M^pro的结合位点和构型，研究发现化合物^5a和^5b在与SARS-CoV-2 M^pro结合时表现出较高的特异性，而它们对MERS-CoV M^pro的抑制效果则相对较弱，这可能与酶的结构差异有关。

为了进一步评估这些化合物的潜在毒性，研究还对它们在Vero细胞和L929细胞中的细胞毒性进行了测试。结果显示，这些化合物在两种细胞系中均表现出较低的细胞毒性，且对L929细胞的毒性低于Vero细胞，这表明它们可能具有一定的安全性和应用潜力。尽管如此，进一步的体外和体内实验仍需进行，以全面评估其作为抗病毒药物的可行性。

研究还强调了重新审视已有化合物库的重要性。尽管这些化合物最初是为寄生虫酶设计的，但它们在抗病毒研究中展现出令人鼓舞的潜力。这种策略不仅能够加快新抗病毒药物的开发，还能够降低研发成本和时间，为应对不断变化的病毒变异提供了一种有效的手段。此外，研究还指出，不同冠状病毒M^pro的结构和结合位点存在差异，因此，针对特定病毒的药物设计需要考虑这些差异，以提高药物的靶向性和有效性。

总体而言，本研究不仅揭示了新的M^pro抑制剂的潜在作用机制，还为未来的抗病毒药物开发提供了重要的理论依据和实验数据。通过结合实验验证和计算模拟，研究人员能够更全面地理解这些化合物的结合特性、作用机制以及潜在的副作用，从而为后续的药物优化和临床试验奠定了基础。未来的研究可以进一步探索这些化合物对病毒变异株的抑制效果，以及它们在体内的药代动力学和安全性。此外，开发具有双重靶向作用的化合物（如同时抑制M^pro和hCatL）可能成为对抗病毒的新策略，以提高抗病毒药物的综合效果。