利用香豆素-硫（硒）氰酸酯衍生物：高效的体内抗增殖剂，可靶向碳酸酐酶

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Harnessing coumarin-thio(seleno)cyanate conjugates: potent In vivo antiproliferative agents targeting carbonic anhydrases

香豆素硫/硒氰酸盐衍生物通过抑制肿瘤相关碳ic酸酶IX和XII诱导细胞周期停滞，在六种人实体瘤细胞系中显示亚微摩尔级抗增殖活性，且对线虫模型中的肿瘤germline具有选择性抑制，同时低剂量对正常组织影响小。

　　### 研究背景与意义

在药物研发的漫长历史中，天然产物一直扮演着重要角色。这些化合物不仅为现代医学提供了大量有效的活性成分，还激发了无数药物的灵感。无论是在传统医学中，还是在现代制药领域，天然产物的广泛使用和持续研究，使它们成为新药开发的关键资源。近年来，随着全球范围内慢性疾病和疫情的增加，天然产物的研究热度持续上升，这主要得益于其在多种疾病治疗中的多靶点特性。许多天然产物不仅能够影响单一的靶点，还能通过多种机制协同作用，这为治疗复杂疾病提供了更全面的策略。

在癌症治疗领域，天然产物及其合成衍生物显示出独特的潜力。它们可以通过多种方式抑制癌细胞的增殖，例如诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制血管生成、调节信号通路，以及靶向关键酶类，如碳酸酐酶（CA）等。其中，CA是一种广泛存在于生物体内的金属酶，主要负责二氧化碳与碳酸氢盐之间的可逆水合反应。在人体中，CA的活性与锌离子密切相关，且CA分为多个基因家族，涉及多种疾病的发生发展，包括癌症。CA IX和CA XII是其中特别受到关注的两个同工酶，它们在缺氧肿瘤中表达上调，参与形成肿瘤的酸性微环境，并影响其生存和转移能力。因此，CA IX和CA XII成为抗癌药物研发的重要靶点。

在本研究中，我们探索了基于香豆素的硫代氰酸酯和硒代氰酸酯衍生物，旨在特异性抑制CA IX和CA XII，并对癌细胞产生抗增殖效应。这些化合物的结构设计考虑了多种变化，包括硫和硒原子的类型、香豆素环上的取代基，以及C-7位的连接链长度。通过调整这些结构特征，我们希望获得更高的选择性，减少对非靶点同工酶（如CA I和CA II）的抑制，从而降低潜在的副作用。

### 化学合成方法

为了合成这些化合物，我们采用了多种有机合成策略。首先，通过Pechmann缩合反应构建香豆素骨架。这一反应通常涉及β-酮酯或β-酮酸与酚类化合物在酸性条件下的缩合，生成具有环状结构的产物。我们选择了四种不同的β-酮酯（2a–2d）和一种酚类化合物（即邻苯二酚），并使用浓硫酸作为催化剂，成功合成了四种不同的7-羟基香豆素（3a–3d）。这些中间体随后通过不同的方法进行功能化修饰，以引入硫代氰酸酯或硒代氰酸酯基团。

在引入硫代氰酸酯基团的过程中，我们采用了一种经典的亲核取代反应。具体而言，将7-氯甲基香豆素（3a）与钾硫氰酸（KSCN）或钾硒氰酸（KSeCN）在干燥的乙腈中加热反应，生成相应的硫代氰酸酯或硒代氰酸酯衍生物。这一反应条件温和，且具有较高的产率，能够有效地引入这些功能基团。

在引入硒代氰酸酯基团时，我们采用了Williamson合成策略。具体而言，通过在碱性条件下将7-羟基香豆素（3b–3d）与不同的α,ω-二溴烷烃进行反应，生成相应的氯代香豆素中间体。随后，通过亲核取代反应将氯原子替换为硒代氰酸酯基团，从而获得最终的硒代氰酸酯衍生物。这种方法不仅适用于硫代氰酸酯的合成，也适用于硒代氰酸酯，从而实现了对两种不同元素的引入。

为了进一步优化这些化合物的结构，我们对香豆素环的C-3和C-4位进行了不同的取代修饰。这些取代基的选择基于它们的电子效应和空间效应，旨在改善化合物的生物活性。例如，C-3位引入甲基或氯原子，而C-4位引入烷基或芳基，从而影响化合物与酶活性位点的相互作用。

此外，我们还对连接链的长度进行了调整。在C-7位引入不同长度的碳链，以改变化合物的疏水性和构象灵活性。这种调整有助于优化其与靶点的结合能力，从而提高其生物活性。通过这些结构修饰，我们成功合成了多个具有不同取代模式和连接链长度的香豆素-硫/硒代氰酸酯衍生物。

### 生物活性评估

在合成这些化合物后，我们进行了广泛的生物活性评估。首先，我们测试了它们对CA IX和CA XII的抑制能力。通过体外酶活性测定，我们发现硫代氰酸酯（4和7b）对CA IX和CA XII表现出显著的抑制活性，其抑制常数（Ki）在17.9–27.4 nM范围内，且对其他同工酶（如CA I和CA II）的选择性超过5000倍。这表明这些化合物在抑制CA IX和CA XII方面具有高度特异性，而对其他同工酶的抑制程度较低，从而降低了非靶点效应。

接下来，我们评估了这些化合物对六种人类实体瘤细胞系的抗增殖活性。这些细胞系包括A549（肺癌）、HeLa（宫颈癌）、MIA PaCa-2（胰腺癌）、SW1573（肺癌）、T-47D（乳腺癌）和WiDr（结肠癌）。其中，T-47D和WiDr细胞系具有多重耐药性，因此它们的抗增殖活性更具挑战性。我们发现，硒代氰酸酯（8a）在这些细胞系中表现出较强的抗增殖活性，其GI50值在0.78–2.6 μM之间，且对多重耐药细胞系的抑制效果优于常用的化疗药物，如5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（CDDP）。

为了进一步理解这些化合物的作用机制，我们进行了细胞周期分析。通过流式细胞术，我们发现，8c（一种硒代氰酸酯）在100 nM浓度下对HeLa细胞的细胞周期产生影响。具体而言，该化合物导致细胞周期中G1期的细胞比例略有下降，而G2/M期的细胞比例有所增加。这种变化表明，化合物可能通过干扰细胞周期的正常进程，抑制细胞增殖。值得注意的是，这种作用并未导致明显的细胞凋亡，而是表现为细胞周期阻滞，说明其作用机制更倾向于细胞生长抑制而非直接细胞死亡。

为了验证这一假设，我们进行了连续的活细胞成像实验。使用三维全息显微镜，我们观察到，8c在15 μM浓度下对SW1573细胞的增殖过程产生干扰。在实验过程中，细胞计数、细胞密度和细胞干重（TDM）保持相对稳定，而对照组细胞则呈现出正常的增殖趋势。这一结果进一步支持了化合物的细胞周期阻滞作用，而非直接的细胞毒性。

### 在线虫模型中的研究

为了评估这些化合物在活体中的作用，我们采用了线虫模型（Caenorhabditis elegans）进行研究。线虫是一种小型土壤寄生虫，其基因组已被完全测序，因此成为研究多种生物过程的理想模型。特别是，线虫的生殖系统（尤其是胚细胞）在研究癌症机制方面具有重要意义，因为维持基因组完整性对防止遗传性癌症至关重要。

我们选择了N2 Bristol株系作为野生型对照，并对一种三重突变株（gld-2(q497); gld-1(q485); gld-4(ef15) I/hT2）进行了研究。该突变株的胚细胞区域由于基因突变，表现出不受控制的增殖，从而形成类似肿瘤的结构。通过将8c（一种硒代氰酸酯）以不同浓度（1–100 μM）作用于这些线虫，我们发现其对胚细胞的增殖具有显著的抑制作用。

具体而言，在50 μM和100 μM浓度下，8c显著减少了胚细胞的数量，并且导致一些胚细胞体积增大。这表明，该化合物可能通过诱导细胞周期阻滞，抑制胚细胞的增殖。此外，我们还发现，在较高浓度下，8c可能导致部分胚细胞的凋亡，但这种效应在较低浓度下并不明显。这一结果表明，8c在较低剂量下可能对癌细胞具有选择性抑制作用，而在较高剂量下则可能对正常组织产生一定的毒性。

进一步的细胞周期分析显示，在8c处理下，线虫的胚细胞表现出类似的细胞周期阻滞现象。具体而言，处理后的胚细胞在G2/M期的停留时间延长，而S期的细胞数量减少。这种现象与在HeLa细胞中观察到的结果一致，表明8c可能通过干扰细胞周期的正常进展，对癌细胞产生抑制作用。此外，我们还发现，8c对正常胚细胞的影响较小，这可能与其选择性作用机制有关。

### 药代动力学与药效学特性

为了评估这些化合物的药代动力学和药效学特性，我们使用SwisADME工具进行了预测。该工具能够分析化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）特性，从而评估其作为潜在药物的可行性。结果显示，这些化合物具有良好的理化性质，包括分子量、脂溶性、氢键相互作用能力、可旋转键数、极性表面积等。此外，它们的药物相似性（drug-likeness）也被认为是可接受的，且没有PAINS（Pan-Assay Interference Compound）警报，这表明它们在药物筛选中具有较低的假阳性风险。

值得注意的是，某些含有苯基结构的硒代氰酸酯（如8e和8f）被预测具有更高的水溶性，而其他化合物则表现出中等水溶性。这可能影响其在体内的分布和代谢过程。此外，我们还发现，部分化合物具有较高的胃肠道吸收能力，这使得它们在口服给药方面具有潜在的优势。通过分析线虫模型中的血脑屏障（BBB）渗透性，我们发现，某些硒代氰酸酯可能能够穿过BBB，从而为脑部肿瘤的治疗提供新的可能性。

### 未来展望

综上所述，本研究开发的基于香豆素的硫代氰酸酯和硒代氰酸酯衍生物，显示出对CA IX和CA XII的特异性抑制作用，并在体外和体内实验中表现出显著的抗增殖活性。这些化合物不仅具有较高的选择性，还能通过细胞周期阻滞机制，对癌细胞产生抑制作用。此外，线虫模型的实验结果进一步验证了这些化合物在活体中的选择性作用，表明其在治疗肿瘤时可能具有较低的毒性。

然而，尽管这些化合物在实验室条件下表现出良好的活性，它们的临床应用仍需进一步研究。例如，需要评估其在人体中的安全性和耐受性，以及其在不同肿瘤类型中的治疗效果。此外，还需探索其在不同治疗方案中的潜在协同作用，以提高其治疗效果并减少副作用。

本研究为开发新型抗癌药物提供了重要的理论基础和实验数据，表明通过合理设计香豆素-硫/硒代氰酸酯衍生物，可以实现对肿瘤相关CA的特异性抑制，并在细胞水平上表现出良好的抗增殖效果。这些化合物的结构设计不仅考虑了其与靶点的结合能力，还优化了其在体内的生物利用度和选择性。未来，随着更多研究的深入，这些化合物有望成为癌症治疗的新靶点，并为开发更安全、更有效的抗癌药物提供新的方向。