通过结合虚拟筛选策略，鉴定出一种新型的高亲和力环肽，该环肽能够靶向Keap1蛋白，用于炎症治疗

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Identification of a novel and high-affinity cyclic peptide targeting Keap1 for inflammation treatment by a combined virtual screening strategy

本研究通过构象药效团建模、分子对接和分子动力学模拟，成功筛选出环状肽-4作为高亲和力（Kd=7.1±0.2nM）的Keap1-Nrf2蛋白相互作用抑制剂。肽-4显著抑制LPS诱导的巨噬细胞中IL-6和TNFα的mRNA（P<0.001）及蛋白表达（P<0.01），且在Keap1-KO细胞中活性丧失，证实其依赖性。血清稳定性测试显示肽-4在240分钟内保留84.95%结构完整度，细胞毒性实验表明其50μM浓度下细胞存活率>95%。

　　炎症是许多疾病的重要病理特征，其核心机制之一与氧化应激密切相关。氧化应激是指体内氧化剂和抗氧化剂之间的平衡被打破，导致活性氧（ROS）的异常积累，从而引发一系列细胞损伤和炎症反应。ROS的过度生成会激活与炎症相关的信号通路，进而促进促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和白细胞介素-6（IL-6）的表达增加。这些促炎因子的持续表达可能引发多种炎症性疾病，如前列腺炎、炎症性肠病、骨关节炎和肺炎等。因此，寻找能够有效调节氧化应激反应的靶向治疗策略成为当前研究的重要方向。

Nrf2（核因子E2相关因子2）和Keap1（Kelch样ECH相关蛋白1）之间的相互作用在调控氧化应激中起着关键作用。Nrf2是一种具有内在抗炎特性的转录因子，它通过结合到抗氧化反应元件（ARE）区域，促进抗氧化酶如血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）的表达，从而中和过量的ROS，缓解炎症反应。在正常生理状态下，Keap1通过与Nrf2结合并招募E3泛素连接酶，促使Nrf2发生泛素化修饰，随后被蛋白酶体降解。然而，在炎症性疾病患者体内，ROS会诱导Keap1中半胱氨酸（Cys）残基的修饰，从而改变Keap1的构象，使其无法有效结合Nrf2，进而导致Nrf2的稳定性上升和核转位增强，激活其抗炎功能。基于这一机制，开发能够特异性抑制Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用（PPI）的化合物，成为治疗炎症性疾病的一种有前景的策略。

尽管已有部分Nrf2激活剂被应用于炎症性疾病的治疗，但这些化合物往往存在靶向性不足的问题。它们可能与含有半胱氨酸残基的其他蛋白发生非特异性结合，导致药效下降或副作用增加。因此，研究者们致力于开发具有更高靶向特异性的小分子抑制剂，以精准调控Keap1-Nrf2相互作用。在这一背景下，环肽因其优异的结构稳定性和较高的结合亲和力，成为一种极具潜力的候选药物。环肽的结构特征使其能够抵抗蛋白酶的降解，从而延长其在体内的作用时间，同时其紧凑的构型有助于与靶蛋白形成稳定的结合。

本研究通过一系列先进的计算和实验方法，对多个环肽进行了系统筛选和评估。首先，基于Keap1的结构信息构建了药效团模型，该模型能够有效预测与Keap1具有潜在结合能力的化合物。接着，使用MOE（分子操作环境）软件平台，对一个包含59,319种环肽的数据库进行了虚拟筛选。筛选过程中，结合了药效团模型、毒性评估、分子对接和分子动力学（MD）模拟等技术，以确保所选化合物不仅具有良好的结合能力，还具备较低的毒副作用和较高的生物可用性。最终，从筛选结果中确定了六个候选环肽（肽1-6），并进一步对它们的结合亲和力和生物活性进行了实验验证。

实验结果显示，肽4在与Keap1的结合过程中表现出最强的亲和力，其解离常数（Kd）为7.1±0.2 nM。相比之下，线性肽的Kd值为170.4±9.1 nM，说明环肽在提高结合亲和力方面具有显著优势。为了进一步验证肽4的结合特性，研究团队还通过微尺度热泳（MST）技术评估了其在不同pH值和温度条件下的结合稳定性。结果表明，肽4在pH 6.0、7.4和8.0的PBST缓冲液中，其Kd值保持稳定，约为7 nM。同时，在5°C、25°C和37°C的条件下，肽4的结合能力也没有明显变化，说明其具有良好的热稳定性。

此外，研究还评估了肽4在人体血清中的稳定性。结果显示，肽4在240分钟的血清孵育后，其结构完整性仍保持在84.95%，远高于线性肽的60%。这表明，肽4具有更强的抗酶解能力，能够在体内维持更长的半衰期，从而提高其治疗效果。为了进一步理解肽4与Keap1的结合机制，研究团队进行了100纳秒的MD模拟，分析了其结合构型的稳定性。结果表明，肽4与Keap1之间的结合在模拟过程中保持稳定，且形成了多达16个氢键，进一步证明了其结合亲和力的优异性。

在细胞毒性评估方面，使用MTT法对肽1-6进行了测试，结果显示它们对RAW264.7巨噬细胞的毒性极低，细胞存活率均高于90%。这表明，肽1-6在体内具有较低的毒副作用，能够安全地用于炎症性疾病的治疗。为了验证肽4的抗炎效果，研究团队在LPS诱导的RAW264.7细胞中进行了反向转录-定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）实验。结果显示，肽4能够显著抑制IL-6和TNFα的mRNA和蛋白表达，其抗炎效果远优于线性肽。更进一步，通过Keap1基因敲除细胞（KO）的实验，研究团队确认了肽4的抗炎活性高度依赖于Keap1。在KO细胞中，肽4未能有效抑制IL-6和TNFα的表达，而野生型细胞（WT）中则表现出显著的抑制作用。这说明，肽4通过特异性结合Keap1，从而激活Nrf2，发挥其抗炎功能。

为了进一步探索肽4的结构特征如何影响其生物活性，研究团队对肽4的结构进行了深入分析。肽4的结构中，Pro78残基的羟基与Keap1的Arg483形成氢键，这一相互作用显著增强了其结合亲和力。此外，肽4的结构中还引入了三元环，使其能够更深入地结合到Keap1的疏水腔中，从而提高其稳定性。与肽3相比，肽4的结构中三元环的引入进一步增强了其与Keap1的结合能力，使其Kd值降低至7.1±0.2 nM。这一结果表明，肽4的结构优化策略在提高结合亲和力方面取得了显著成效。

在现有研究中，针对Keap1的环肽抑制剂往往存在结合亲和力不足的问题。例如，肽Ac-DPETGEL-OH的Kd值为2.1 μM，而环肽c[GQLDPETGETL]的Kd值为18.12 nM，环肽c[KLDEETGEQ]的Kd值为51 nM，环肽c[Dha-DPEFTG]的Kd值为20±2 nM。相比之下，肽4的Kd值显著低于这些已知的环肽，表现出更强的结合能力。这一结果表明，肽4的结构设计在提高结合亲和力方面具有独特优势，为开发更高效的Keap1-Nrf2 PPI抑制剂提供了新的思路。

综上所述，本研究通过结合计算筛选与实验验证的方法，成功筛选并验证了肽4作为针对Keap1的高亲和力环肽抑制剂的潜力。肽4不仅表现出优异的结合亲和力，还具有良好的血清稳定性和低细胞毒性，能够在不引起明显副作用的情况下有效抑制促炎因子的表达。此外，其抗炎效果高度依赖于Keap1，进一步验证了其作用机制的正确性。这些结果表明，肽4可能成为治疗炎症性疾病的一种新型候选药物。未来的研究可以进一步探索其在动物模型和临床试验中的应用，以评估其在人体中的治疗效果和安全性。