长期意识障碍患者的口腔微生物群发生改变

《Journal of Oral Microbiology》：Altered oral microbiomes in patients with prolonged disorders of consciousness

本研究分析89例持续性意识障碍患者的口腔微生物组，发现静息态（VS）与恢复状态（EMCS）患者的β多样性及菌群结构存在显著差异，抗生素使用显著改变VS患者的微生物组成，并构建了高预测价值的预后模型（AUC 0.820-0.920）。

　　### 口腔微生物群在长期意识障碍患者中的作用研究

近年来，随着对微生物群与宿主健康之间关系的深入研究，人们逐渐认识到口腔微生物群在维持口腔健康及全身健康中的重要性。特别是在长期意识障碍（prolonged disorders of consciousness, pDoC）患者中，尽管已有大量研究关注中枢神经系统的变化，但对周围生理环境，尤其是微生物群的影响却鲜有探索。pDoC包括意识障碍状态（vegetative state, VS）、最小意识状态（minimally conscious state, MCS）以及从MCS中恢复（emerging from MCS, EMCS）等不同阶段。这些患者通常由于脑损伤、中风或缺氧性脑病等原因导致意识功能受损，往往依赖鼻饲营养，且口腔活动受限，这些因素可能显著影响其口腔微生物群的组成和功能。

### 研究方法

本研究纳入了89名pDoC患者，其中包括21名VS患者、46名MCS患者和22名EMCS患者。研究通过16S rRNA测序技术分析了这些患者口腔微生物群的差异。研究特别关注了抗生素使用对微生物群的影响。研究者将患者分为抗生素使用组和未使用组，并对两组之间的微生物组成进行了比较。此外，研究还通过构建预测模型，评估了特定微生物群对pDoC患者长期预后的影响。

在样本采集方面，研究者使用无菌棉签从患者的上颚和下颚牙龈表面采集微生物样本，并将样本保存在-80℃的冷冻管中，直到DNA提取完成。DNA提取采用十二烷基硫酸钠（SDS）方法，随后通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，并将DNA稀释至1ng/μL。16S rRNA V4区的扩增和测序使用了Phusion?高保真PCR Master Mix和GC缓冲液，并结合了测序库制备和质量评估步骤。

在数据分析方面，研究采用了多种方法，包括α多样性分析（如Chao1、Shannon、Simpson和ACE指数）和β多样性分析（如加权和非加权UniFrac距离、Bray–Curtis距离和二元Jaccard距离）。研究还利用主成分分析（PCA）和层次聚类分析（hierarchical clustering）来可视化不同组之间的微生物群差异。此外，研究通过LEfSe方法识别了在不同组之间具有统计学意义和生物学相关性的微生物群，并通过VIP评分进一步筛选出对分组具有显著贡献的微生物群。

### 研究结果

研究发现，pDoC患者中，EMCS组的β多样性显著高于VS组，表明EMCS患者的口腔微生物群结构更为复杂。这可能与EMCS患者恢复部分意识功能有关，反映了更健康的微生物群组成。然而，在MCS组和VS组之间，α和β多样性未见显著差异，这可能与两组患者临床特征的相似性或样本量较小有关。PCA分析和层次聚类分析进一步验证了这些发现，表明EMCS组和VS组在微生物群组成上存在明显差异，而MCS组则相对接近VS组。

在抗生素使用对微生物群的影响方面，研究发现仅在VS组中观察到显著的微生物群变化。抗生素治疗的VS患者显示α多样性下降，β多样性上升，这可能是因为VS患者口腔活动受限，导致抗生素在口腔内滞留时间较长，从而对微生物群造成更显著的影响。相比之下，MCS和EMCS患者由于口腔活动较为正常，能够更有效地清除口腔中的微生物，从而减轻抗生素对微生物群的扰动。

研究还发现，某些特定的微生物群与患者的预后密切相关。在抗生素治疗的患者中，预测模型基于差异性微生物群和优势微生物群构建，显示出良好的预测性能，其中基于优势微生物群的模型达到0.921的AUC值，表明其在预后评估中的潜在价值。这些微生物群可能作为pDoC患者恢复意识的生物标志物，为临床决策提供新的依据。

### 研究讨论

本研究揭示了pDoC患者口腔微生物群与意识状态之间的复杂关系。EMCS患者的口腔微生物群多样性较高，这可能与其更好的神经功能状态有关。而VS患者的口腔微生物群则表现出较低的多样性，这可能与其严重的意识障碍和口腔活动受限有关。研究还发现，某些特定的微生物群可能在疾病进展和恢复过程中起到关键作用。例如，VS患者中富集的Campylobacter showae、Phocaeicola abscessus和Lachnospiraceae等微生物群，已被证明与多种神经系统疾病相关，可能在意识障碍的病理生理过程中发挥重要作用。

另一方面，EMCS患者中富集的Streptococcus danieliae和Corynebacterium durum等微生物群，通常被认为是口腔健康的有益菌群。这些菌群可能通过产生过氧化氢和细菌素，抑制病原菌的生长，从而维持口腔微生态平衡。此外，某些微生物群可能通过影响代谢和神经通路，间接影响意识状态和神经功能。

在抗生素使用方面，研究发现抗生素对VS患者的口腔微生物群产生了显著影响，但对MCS和EMCS患者的影响较小。这可能是因为VS患者口腔活动受限，导致抗生素在口腔内停留时间更长，从而对微生物群造成更显著的扰动。而MCS和EMCS患者由于能够进行一定程度的口腔活动，如吞咽，可能有助于微生物群的自然恢复，减少抗生素对微生物群的负面影响。

研究还发现，微生物群的组成可能受到意识状态和抗生素使用等多种因素的影响。β多样性分析显示，抗生素使用和受伤后时间与微生物群结构存在独立的关联。这表明，微生物群的变化可能是由于受伤后的逐渐累积效应，而非单一因素的直接影响。因此，pDoC患者的口腔微生物群变化可能是一个复杂的生态过程，涉及多个因素的相互作用。

### 研究意义

本研究首次系统地探讨了pDoC患者口腔微生物群的组成及其与意识状态和预后之间的关系，为理解微生物群在神经系统疾病中的作用提供了新的视角。研究结果表明，口腔微生物群的改变可能不仅影响口腔健康，还可能通过代谢和免疫途径影响神经系统功能和意识恢复。因此，未来的研究应关注如何通过维持有益微生物群和抑制有害微生物群的过度生长，来促进pDoC患者的意识恢复。

此外，研究中发现的微生物群标志物可能为临床评估和管理pDoC提供新的工具。考虑到当前临床评估工具的局限性，这些微生物群标志物可能成为非侵入性、可操作的预后指标，帮助医生更准确地预测患者的恢复可能性，并制定个性化的治疗方案。然而，研究也指出了其局限性，如样本量较小、缺乏动态生理测量等，未来需要进一步扩大样本量，并采用多中心和纵向研究设计，以验证这些初步发现并提高其临床适用性。

总之，本研究为理解pDoC患者口腔微生物群的组成及其与意识状态和预后之间的关系提供了重要的科学依据，强调了微生物群在神经系统疾病中的潜在作用，并为未来的临床研究和干预策略提供了新的方向。