半趾壁虎（Hemidactylus bowringii，属于有鳞目壁虎科）的完整线粒体基因组及其系统发育分析

《Mitochondrial DNA Part B》：The complete mitochondrial genome and phylogenetic analysis of Hemidactylus bowringii (Squamata: Gekkonidae)

该研究完成中国树蟒Hemidactylus bowringii的完整线粒体基因组测序（17091bp），揭示其基因排列与Gekkonidae科其他物种高度一致，并发现控制区碱基组成存在显著差异。通过17种壁虎类及2个无尾目物种的系统发育分析，确认该物种在科内处于中间演化地位，支持线粒体基因组在物种鉴定和适应性进化研究中的关键作用。

　　Hemidactylus bowringii Gray, 1845，作为壁虎科（Gekkonidae）中的一个物种，因其在生态学上的重要性以及对多种环境的适应能力而受到广泛关注。该物种的线粒体DNA被描述为一个紧凑的17,091个碱基对（bp）的环状分子，其腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）含量为53.8%。线粒体基因组包含37个典型的线粒体基因，其中包括13个蛋白质编码基因（PCGs）、2个核糖体RNA（rRNAs）、22个转运RNA（tRNAs）以及一个非编码调控区域。本研究基于17个物种的线粒体基因组序列，结合两个外群物种（Sphenomorphus indicus和Calotes versicolor）的序列，重建了系统发育树。这项新发现的线粒体基因组为壁虎科蜥蜴的保护基因组学和系统发育研究提供了基础资源。

在生态学和生物学研究中，H. bowringii因其独特的适应性而备受关注。该物种在不同环境条件下表现出显著的生存能力，尤其是在温暖的气候条件下，其幼体在30°C的温度下孵化时，体形更大，运动表现更佳。这一现象表明，温度对物种的生长发育具有重要影响。此外，H. bowringii在断尾后仍能保持运动能力，这在许多其他壁虎科物种中并不常见，进一步凸显了其在生理适应方面的独特性。这种能力可能与其特殊的生理机制有关，为研究蜥蜴类动物的再生和适应性提供了新的视角。

尽管H. bowringii具有这些生物学特性，但其线粒体基因组与这些特征之间的潜在遗传联系尚不明确。此前仅有一份H. bowringii的线粒体基因组序列（KM508815）被报道，但该序列尚未公开发布，且缺乏原始数据、元数据和详细的注释。因此，本研究旨在通过对地理上隔离的H. bowringii个体进行完整的线粒体基因组测序，填补这一空白。研究团队采集了一只成年雄性个体，并在广东省深圳市的聂岭顶岛进行样本保存。样本的采集和保存遵循严格的科学规范，确保了基因组数据的完整性和准确性。

线粒体基因组的测序和分析采用了先进的高通量测序技术，使用Illumina NovaSeq 6000平台生成150 bp的配对端读取数据。通过Trimmomatic软件进行质量控制，确保数据的可靠性。随后，使用metaSPAdes装配器对数据进行处理，该工具在处理多生物体基因组数据方面表现出色。为了提高注释的准确性，研究团队还采用了MitoMaker工具进行自动注释，从而生成了一个近似完整的线粒体基因组序列。最终的序列被提交至GenBank数据库，获得了访问号PQ462284。

在系统发育分析方面，研究团队从GenBank数据库中获取了20个H. bowringii的线粒体基因组序列，以及两个外群物种的序列（Sphenomorphus indicus和Calotes versicolor）。通过选择具有高查询覆盖率和序列相似性的基因组序列，研究团队构建了一个包含19个物种的系统发育树。使用最大似然法（Maximum Likelihood, ML）进行分析，并通过1000次自举重复（bootstrap replicates）验证了系统发育树的稳定性。结果显示，系统发育树具有良好的支持度和分辨率，为理解Hemidactylus属的进化关系提供了新的证据。

线粒体基因组的结构分析显示，H. bowringii的基因组与大多数壁虎科物种的线粒体基因组结构相似。蛋白质编码基因（PCGs）的分布显示出明显的链特异性，其中ND6和8个tRNA基因位于轻链（light strand），而其余的12个PCGs、14个tRNA基因以及2个rRNA基因则位于重链（heavy strand）。这一基因分布模式与已知的壁虎科线粒体基因组结构一致，表明该物种在进化过程中保留了较为保守的基因排列方式。此外，研究团队还发现，H. bowringii的线粒体基因组中存在一些独特的特征，如某些基因的起始密码子和终止密码子的使用模式。例如，ND2、ND3和ND5基因的起始密码子为ATA，而ND1、ND4L和ND6基因的起始密码子为GTG。终止密码子则包括TAA、TAG、AGA和AGG，其中某些基因（如ND2、COX2、COX3和ND3）表现出不完整的终止密码子，这可能是线粒体基因组进化过程中的一种现象。

通过比较新测序的H. bowringii线粒体基因组（PQ462284）与之前报道的序列（KM508815），研究团队发现两者之间的未校正p距离约为0.002，表明它们之间存在一定的遗传差异。这种差异可能与地理隔离有关，因为新测序的样本来自岛屿，而KM508815可能来源于大陆地区。此外，新测序的线粒体基因组在某些基因（如ND4）中表现出不同的不完整终止密码子模式，这可能是由于长期的地理隔离导致的遗传变异。然而，为了进一步确认这一假设，需要更广泛的种群水平基因组分析。

在系统发育分析中，研究团队发现所选的17个壁虎科物种之间并没有特别紧密的亲缘关系，这表明目前在Hemidactylus属中线粒体基因组数据的获取仍然有限。因此，重建爬行纲（Squamata）的系统发育树仍然面临挑战，尤其是在线粒体基因组采样不足的情况下。尽管如此，本研究提供了H. bowringii的完整线粒体基因组序列，这将有助于更准确地识别该物种，同时为保护基因组学和适应性进化研究提供重要的数据支持。

此外，H. bowringii的线粒体基因组在基因组成和排列上具有一定的保守性，这与许多其他壁虎科物种相似。然而，其基因组的某些特征，如不完整的终止密码子模式，可能反映了其独特的进化路径。这些特征不仅有助于理解H. bowringii的遗传机制，还可能为其他壁虎科物种的进化研究提供参考。研究团队在分析过程中还发现，H. bowringii的线粒体基因组长度超过了其他同属物种的报告长度，这可能是由于基因组中存在更多的非编码区域或某些基因的扩展。

本研究的系统发育分析结果与先前基于DNA序列的研究结果一致，表明Hemidactylus属的线粒体基因组在系统发育关系上具有一定的稳定性。然而，由于线粒体基因组数据的缺乏，重建更广泛的爬行纲系统发育树仍然存在困难。因此，未来的研究需要进一步扩大线粒体基因组的采样范围，以提高系统发育分析的准确性和分辨率。这不仅有助于更全面地理解壁虎科物种的进化历史，还可能揭示更多关于蜥蜴类动物适应性进化的机制。

在实际应用方面，H. bowringii的线粒体基因组数据对保护生物学和遗传学研究具有重要意义。由于该物种在传统中药中被广泛使用，其商业利用和人工繁殖可能导致种群数量的下降。因此，了解其遗传结构和系统发育关系有助于制定有效的保护策略，确保其种群的可持续性。此外，线粒体基因组的完整序列还可以用于研究该物种的适应性进化，例如其对温度变化的耐受性、断尾后的运动能力等。这些研究不仅有助于理解H. bowringii的生物学特性，还可能为其他具有类似适应性的物种提供参考。

从伦理角度来看，本研究的样本采集和处理遵循了严格的科学规范和伦理准则。研究得到了东北林业大学的伦理审查委员会批准，并按照该大学的相关规定进行样本采集和保存。所有研究活动均符合广东省的相关法规，确保了研究的合法性和科学性。此外，研究团队还提供了额外的补充材料，包括英文编辑证书，以确保研究内容的准确性和可读性。

总的来说，本研究不仅提供了H. bowringii的完整线粒体基因组序列，还通过系统发育分析揭示了该物种在壁虎科中的进化地位。这些数据为保护基因组学、系统发育研究以及适应性进化研究提供了重要的资源。未来的研究可以进一步利用这些数据，探索H. bowringii的遗传机制及其在生态系统中的作用，从而为生物多样性保护和生态学研究提供更深入的理解。