Viola grayi（堇菜科）的完整叶绿体基因组序列及其系统发育分析

《Mitochondrial DNA Part B》：The complete chloroplast genome sequence and phylogenetic analysis of Viola grayi (Violaceae)

叶绿体基因组研究揭示日本海浪花（Viola grayi）的系统发育地位，首次完成其完整叶绿体基因组测序（158,408 bp），包含LSC、SSC及IR区，基因组成与已知 violet 种类一致。基于22种紫花科植物的叶绿体基因组系统发育分析，该物种与近缘种Viola grypoceras形成强支持单系群（BP=100），证实其独立分类地位。基因组数据为物种界定及进化研究提供重要资源。

　　Viola grayi，作为Violaceae科中Rostratae亚属的一个直立生长物种，适应于沿海沙丘环境，其叶片具有革质特性，近日首次被报道其完整的叶绿体基因组序列。该基因组全长为158,408个碱基对，由一个大的单拷贝区（86,662个碱基对）、一个较小的单拷贝区（17,994个碱基对）以及两个反向重复区（各26,876个碱基对）组成。通过对22个Viola物种的叶绿体基因组进行系统发育分析，结果表明该属为单系类群，且Viola grayi与Viola grypoceras形成了一个高度支持的单系分支（BP = 100）。这一叶绿体基因组为未来在该属中进行比较、分类、系统发育和进化研究提供了宝贵的基因资源。

Viola grayi最早由Franchet和Savatier于1879年描述，是一种原产于日本的直立生长植物，其特征为无毛且具有较短且粗壮的距。该物种主要分布在从鸟取县到北海道的沿海沙丘，偶尔也出现在青森县。在最初被描述后，由于其与Viola grypoceras在形态上的相似性，Viola grayi曾被归类为该种的一个变种。然而，随着研究的深入，发现Viola grayi具有独特的叶片结构，其叶片较厚且略带光泽，与Viola grypoceras存在显著差异，因此被重新认定为一个独立的物种。近年来，使用简单重复序列（SSR）标记的研究表明，Viola grayi与其他相关内陆物种存在明显的遗传分化，这一发现与形态分类结果一致，进一步支持其作为独立物种的分类地位。

Viola grayi的遗传多样性较低，且种群间分化程度较高，这表明其种群结构较为独特，也凸显了其在生态系统中的重要性以及保护的必要性。此外，关于其种子萌发特性的研究表明，冬季温度的升高会导致其种子休眠期延长，这可能对种群的生存构成潜在威胁。由于Viola grayi主要分布于沿海沙丘，其种子萌发依赖于特定的环境条件，因此对其种群的保护和管理需格外谨慎。然而，目前关于Viola grayi的全面遗传数据仍较为缺乏，尤其是完整的叶绿体基因组信息，这在一定程度上限制了其遗传保护和准确分类的实现。

叶绿体DNA因其高度保守性和较慢的进化速率，成为解析不同分类层级间系统发育关系的重要工具。近年来的研究进一步表明，完整的叶绿体基因组序列在Viola属的物种鉴定中具有超级条形码的作用，即能够提供高精度的物种识别信息。基于此背景，我们对Viola grayi的完整叶绿体基因组进行了测序，以确定其在该属中的系统发育位置，并为未来的分类和进化研究建立基因参考。此次研究不仅有助于明确物种边界，还为理解Rostratae亚属内的系统发育关系提供了新的视角。

本次研究的样本采集自日本青森县阿贺市的Tenbinno地区，采样时间为2023年9月30日。样本保存于Kangwon National University Herbarium（KWNU），编号为KWNU103412。采集的叶片样本迅速置于硅胶中干燥，随后使用DNA Plant Mini Kit提取基因组DNA。提取的DNA被外包至LabGenomics Co., Ltd.进行测序，使用Illumina MiSeq平台生成了5,911,975对端测序数据，平均读长为301个碱基对。基因组的从头组装使用Geneious 7.1.9软件完成。通过将Illumina对端读取数据映射到组装结果，评估了测序深度，并使用SAMtools v1.17计算了每个碱基的覆盖度，最终使用Python 3.10进行可视化。此外，通过比较Viola acuminata的叶绿体基因组（GenBank编号MW802528），对Viola grayi的基因组进行了注释和手动校正。对于需要转录剪接的基因（如rps12），我们通过对比Viola acuminata、Viola grypoceras和Viola websteri的叶绿体基因组，对其进行了精确的注释。最终，使用OGDRAW v1.3.1软件创建了Viola grayi叶绿体基因组的环形图，以便于进一步分析其基因组成和结构。

Viola grayi的叶绿体基因组全长为158,408个碱基对，GC含量为36.2%。测序深度平均为689倍，最低为234倍，最高为3219倍。该基因组具有典型的四部分结构，包括一个大的单拷贝区（86,662个碱基对）、一个较小的单拷贝区（17,994个碱基对）以及两个反向重复区（各26,876个碱基对）。基因组中共包含131个基因，其中包括84个蛋白质编码基因、37个tRNA基因、8个rRNA基因以及2个假基因。反向重复区中包含17个重复基因，其中包括7个蛋白质编码基因（如ndhB、rpl2、rpl23、rps7、rps12、ycf2和ycf15），4个rRNA基因（如rrn16、rrn23、rrn4.5和rrn5）以及6个tRNA基因（如trnA-UGC、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG和trnV-GAC）。此外，有19个包含内含子的基因被鉴定出来，其中包括13个蛋白质编码基因和6个tRNA基因。其中，10个蛋白质编码基因（如atpF、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl2、rpl16和rpoC1）以及6个tRNA基因（如trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA和trnV-UAC）各包含一个内含子。而三个蛋白质编码基因（如clpP、rps12和ycf3）则包含两个内含子。整体来看，Viola grayi的叶绿体基因组结构与之前报道的其他Viola物种高度一致，表明其在进化过程中保持了较高的基因组稳定性。

在系统发育分析中，我们使用了22个Viola物种的完整叶绿体基因组序列以及一个外类群Passiflora edulis的基因组序列（GenBank编号NC_034285）进行比对，最终得到184,817个碱基对的对齐结果。分析结果表明，Viola属为单系类群，且Viola grayi与Viola grypoceras形成了一个高度支持的单系分支（BP = 100），进一步确认了它们之间的密切遗传关系。此外，Viola属被划分为两个主要的分支：一个包括Plagiostigma节和Chamaemelanium节，另一个则包含Viola节。Viola节又被细分为两个亚节，即Viola亚节和Rostratae亚节，这一分类体系由Marcussen等人（2022）提出。Viola grayi被归入Rostratae亚节，与Viola grypoceras共同构成一个高度支持的单系分支，这为理解该亚属内的系统发育关系提供了新的依据。

在系统发育树中，Viola grayi的位置被特别标注，以红色突出显示。该树的节点处标注了Bootstrap（BP）值，其中星号表示节点具有100%的Bootstrap支持。此次分析使用的物种包括Viola acuminata（MW802528）、Viola biflora（OM177182）、Viola collina（MW802530）、Viola diffusa（PP952083）、Viola dissecta（MW802531）、Viola grypoceras（OM055663）、Viola inconspicua（MW802532）、Viola kusanoana（OM177180）、Viola mirabilis（MH229816）、Viola monbeigii（Cao et al.）、Viola mongolica（ON548135）、Viola phalacrocarpa（MH229817）、Viola philippica（MZ343563）、Viola prionantha（MW802538）、Viola raddeana（MH229818）、Viola selkirkii（MW448361）、Viola ulleungdoensis（MW477469）、Viola variegata（MW802539）、Viola websteri（MH229819）、Viola yezoensis（MW802540）以及Viola yunnanfuensis W. Becker（MW802541）。这些物种的叶绿体基因组序列被用于构建系统发育树，以揭示Viola属内部的演化关系。

在核苷酸多样性（Pi）分析中，我们使用DnaSP 6软件计算得出Viola grayi的Pi值为0.00094，这一数值高于其他相关Viola物种对（如Viola monbeigii和Viola philippica，Pi值为0.00039）。尽管Pi值本身不足以作为确定物种界限的唯一依据，但其仍支持将Viola grayi视为一个独立的演化支。这一结果与Hirai等人（2012）基于核SSR标记的研究一致，表明Viola grayi与其他相关物种存在明显的遗传分化。此外，此次研究提供的叶绿体基因组数据为未来在该属中进行分类、系统发育和进化研究提供了重要的基因资源，有助于更准确地界定物种边界，并揭示该属内部的演化关系。

Viola grayi的叶绿体基因组不仅提供了关于其基因结构的详细信息，还揭示了其与近缘物种之间的遗传关系。这一数据的获取和分析为研究该属的演化历史和系统发育提供了重要的支持。叶绿体基因组的稳定性使得其成为研究植物系统发育关系的理想工具，而Viola grayi的基因组则为这一工具的应用提供了新的案例。此外，叶绿体基因组在物种鉴定中的超级条形码作用，使得其成为区分Viola属内不同物种的重要依据。Viola grayi的基因组序列为这一功能的实现提供了具体的数据支持。

从生态适应性角度来看，Viola grayi主要分布于沿海沙丘，其生长环境具有一定的特殊性。这种特殊性使得Viola grayi在形态和生理上与其他内陆物种存在显著差异，这也进一步支持其作为独立物种的分类地位。由于其生长环境的限制，Viola grayi对特定的环境条件依赖较强，这在一定程度上增加了其生存的不确定性。因此，了解其基因组信息对于保护该物种及其生态环境具有重要意义。同时，叶绿体基因组的获取也为研究其对环境变化的适应机制提供了可能。

此次研究不仅填补了Viola grayi叶绿体基因组信息的空白，还为该属的系统发育研究提供了新的数据支持。Viola grayi的基因组结构与功能分析为未来研究提供了丰富的信息，有助于进一步理解该属的演化历史和遗传多样性。此外，Viola grayi的基因组数据为相关研究提供了宝贵的资源，包括分类、系统发育和进化分析。这些数据不仅有助于明确物种之间的关系，还为研究该属的生态适应性和遗传机制提供了基础。

在研究方法上，我们采用了多种现代生物技术手段，包括DNA提取、高通量测序、基因组组装和注释等。这些技术的综合应用确保了数据的准确性和可靠性。通过使用Illumina MiSeq平台进行测序，我们获得了高质量的基因组数据，为后续分析提供了坚实的基础。基因组的从头组装和注释确保了我们能够全面了解其基因组成和结构。此外，使用OGDRAW v1.3.1软件创建的环形图不仅有助于直观展示基因组结构，还为后续的系统发育分析提供了支持。

此次研究的成果具有重要的科学价值，为Viola属的分类、系统发育和进化研究提供了新的视角。Viola grayi的基因组数据为未来研究提供了丰富的资源，有助于更准确地界定物种边界，并揭示该属内部的演化关系。此外，Viola grayi的基因组数据也为相关研究提供了重要的支持，包括其对环境变化的适应性、遗传多样性以及种群结构等。这些数据的获取和分析不仅有助于理解Viola属的演化历史，还为保护该物种及其生态环境提供了科学依据。

Viola grayi的叶绿体基因组数据的发布，不仅为研究该属的系统发育关系提供了重要支持，还为未来的分类和进化研究奠定了基础。此外，该基因组数据为研究其对环境变化的适应性提供了可能，特别是在全球气候变化背景下，其种子休眠期的延长可能对其种群生存构成潜在威胁。因此，了解Viola grayi的基因组信息对于制定有效的保护策略具有重要意义。同时，该基因组数据也为相关研究提供了丰富的资源，有助于进一步理解该属的演化历史和遗传多样性。

综上所述，Viola grayi的叶绿体基因组数据的获取和分析，为该属的系统发育研究提供了新的视角，同时也为未来的分类、进化和生态研究奠定了基础。该基因组数据不仅有助于明确物种之间的关系，还为研究其对环境变化的适应性提供了可能。此外，Viola grayi的基因组数据为相关研究提供了重要的支持，有助于更准确地界定物种边界，并揭示该属内部的演化关系。这些数据的发布，不仅填补了Viola grayi基因组信息的空白，还为该属的分类和系统发育研究提供了新的案例。