CERK1在甜瓜中参与由几丁质引发的活性氧生成过程，并且在葫芦科植物中具有广泛的保守性

《Plant Signaling & Behavior》：CERK1 is required for chitin-triggered reactive oxygen species generation in melon and is broadly conserved in cucurbits

本研究发现黄瓜和蜜瓜中存在CERK1同源基因，通过病毒诱导基因沉默证实CmCERK1是几丁质识别并激活ROS信号通路的关键，且该基因在多个蜜瓜品种中高度保守。

　　在自然界中，植物与微生物之间的相互作用构成了生态系统中至关重要的组成部分。植物不仅需要从土壤中获取养分，还必须防御来自病原体的侵害，这些病原体包括细菌、真菌和病毒等。为了应对这些威胁，植物进化出了一套复杂的免疫系统，该系统能够识别并响应病原体的入侵。这种免疫系统通常分为两个层级：第一层级是先天免疫，依赖于植物表面的受体来识别病原体的特定分子模式；第二层级则是适应性免疫，通常涉及更复杂的信号传导路径和基因表达调控。其中，模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）是植物先天免疫系统的重要组成部分，它们能够识别病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs）并启动防御反应。

在植物免疫研究中，研究者们发现某些分子能够作为病原体的信号分子，例如细菌的鞭毛蛋白（flagellin）和真菌的几丁质（chitin）。几丁质是一种由真菌细胞壁和昆虫外骨骼组成的多糖，具有高度的结构稳定性，对真菌的生存至关重要。然而，植物能够通过特定的受体识别几丁质，将其视为病原体的入侵信号，并启动相应的免疫反应。例如，在拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，CERK1（Chitin Elicitor Receptor Kinase 1）是一种重要的几丁质识别受体，它能够感知几丁质并激活植物的免疫反应，包括快速产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。此外，CERK1在番茄、水稻和小麦等植物中也存在功能性的同源基因，表明这一基因在植物免疫系统中具有广泛的重要性。

尽管CERK1在多种植物中被发现具有重要作用，但目前对葫芦科（Cucurbitaceae）植物中几丁质触发免疫反应的研究仍然有限。葫芦科植物包括黄瓜（*Cucumis sativus*）、甜瓜（*Cucumis melo*）、西瓜（*Citrullus lanatus*）、南瓜和南瓜属植物（*Cucurbita* spp.）等，这些植物在全球范围内被广泛种植，因其营养价值和口感而受到消费者的喜爱。然而，由于病原体的侵袭，葫芦科植物常常遭受严重的产量和质量损失。因此，了解葫芦科植物如何识别和应对病原体的入侵，尤其是几丁质触发的免疫反应，对于提高作物抗病能力具有重要意义。

在本研究中，科学家们首先对黄瓜和甜瓜进行了实验，观察几丁质是否能够触发这两种植物的免疫反应。他们发现，当黄瓜和甜瓜受到几丁质处理时，会迅速产生ROS，这表明这些植物能够识别几丁质并启动免疫反应。接下来，他们利用拟南芥CERK1的氨基酸序列，在黄瓜和甜瓜中进行了同源搜索，从而鉴定出可能的CERK1同源基因。结果显示，黄瓜中存在三个候选同源基因，其中XP_011658694.1与CmCERK1（甜瓜中的CERK1同源基因）具有最高的序列相似性，因此被命名为CsCERK1（黄瓜中的CERK1同源基因）。甜瓜中的CmCERK1与黄瓜中的CsCERK1具有相似的结构特征，包括两个LysM结构域、一个跨膜结构域和一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。

为了进一步验证CmCERK1在几丁质触发免疫反应中的作用，研究者们采用了病毒诱导基因沉默（Virus-Induced Gene Silencing, VIGS）技术。他们利用苹果潜隐球状病毒（Apple Latent Spherical Virus, ALSV）载体，对甜瓜的CmCERK1基因进行了沉默处理。结果显示，CmCERK1被沉默后，甜瓜在几丁质处理下产生的ROS显著减少，而对照组（未被沉默的甜瓜）则仍然表现出高水平的ROS积累。这表明CmCERK1在几丁质触发的免疫反应中起到了关键作用。此外，他们还对多个商业甜瓜品种进行了基因组PCR分析，发现所有测试的品种都保留了完整的CmCERK1基因，这说明CmCERK1在葫芦科植物中具有高度的保守性。

进一步的研究还表明，CERK1基因在葫芦科植物中不仅在甜瓜中高度保守，而且在其他葫芦科植物中也广泛存在。通过对28个已发布的葫芦科植物基因组进行分析，研究者们发现了多个CERK1同源基因，这些基因在结构和功能上与CmCERK1相似。这表明CERK1在葫芦科植物的进化过程中被高度保留，可能与这些植物长期受到真菌病害（如白粉病、霜霉病和炭疽病）的持续压力有关。此外，CERK1不仅在植物免疫中发挥作用，还可能参与与微生物的共生关系。例如，在水稻中，CERK1被发现能够识别丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）的共生信号，而在其他植物如豌豆和苜蓿中，CERK1同源基因也被报道参与共生和免疫反应。这表明CERK1可能具有更广泛的生物学功能，不仅限于病原体识别，还可能涉及植物与有益微生物之间的互作。

在讨论部分，研究者们进一步探讨了CERK1在葫芦科植物中的功能和进化意义。他们指出，尽管CERK1在拟南芥中被确认为几丁质识别的主要受体，但在水稻中，几丁质识别主要依赖于CEBiP（Chitin Elicitor Binding Protein），而在黄瓜和甜瓜中，CERK1可能扮演着类似的角色。此外，研究者们还提到，尽管InterProScan分析未能检测到CmCERK1和CsCERK1中的第一个LysM结构域，但通过序列比对，他们推测这两个结构域可能仍然存在，且具有较高的同源性。这表明，尽管某些分析方法可能遗漏部分结构域，但通过综合多种实验手段，可以更全面地理解CERK1的结构和功能。

为了深入研究CERK1在葫芦科植物中的作用，研究者们还提出了一个假设的防御信号传导模型。该模型认为，CmCERK1可能与一个拟南芥中类似的LYK5蛋白形成受体复合物，共同感知几丁质信号。一旦几丁质被感知，该复合物会激活RBOH（Respiratory Burst Oxidase Homolog）同源蛋白，如CmRBOH，从而引发ROS的生成。ROS的积累是植物免疫反应的重要标志之一，能够直接抑制病原体的生长，同时激活一系列防御相关基因的表达。然而，目前CmLYK5和CmRBOH基因尚未被鉴定，因此需要进一步的实验来验证这些假设。

在方法部分，研究者们详细描述了实验所采用的技术手段，包括植物材料的准备、ROS的检测、VIGS实验的设计和实施，以及基因表达的定量分析。例如，为了测量ROS的产生，他们使用了基于鲁米诺（luminol）的发光法，该方法能够灵敏地检测植物细胞中活性氧的水平。他们从黄瓜和甜瓜的真叶中制备叶盘，并在黑暗条件下进行预处理，随后在含有几丁质的培养基中进行检测。这种方法能够有效评估几丁质对植物免疫反应的影响。

在VIGS实验中，研究者们构建了两个不同的沉默载体：一个针对CmCERK1的跨膜结构域（TM domain），另一个针对其激酶结构域（kinase domain）。通过将这些载体导入甜瓜的幼叶中，他们能够观察到CmCERK1的表达水平变化以及ROS的生成情况。结果显示，CmCERK1的沉默显著降低了甜瓜对几丁质的免疫反应，而对照组的甜瓜仍然表现出正常的ROS积累。这表明CmCERK1在几丁质触发的免疫反应中是不可或缺的。

此外，研究者们还通过基因组PCR和定量RT-PCR技术，验证了CmCERK1在不同商业甜瓜品种中的保守性。他们发现，所有测试的甜瓜品种都保留了完整的CmCERK1基因，并且在几丁质处理下均表现出ROS的积累。这一结果进一步支持了CmCERK1在葫芦科植物中具有高度保守性的观点。相比之下，CmFLS2（一种与细菌鞭毛蛋白识别相关的PRR）在某些商业甜瓜品种中可能已经丢失，这表明在作物驯化过程中，某些免疫相关基因可能被选择性地保留或丢失。

为了全面分析CERK1在葫芦科植物中的分布和功能，研究者们还对多个葫芦科植物的基因组进行了系统性的同源搜索。他们利用BLASTP方法，以拟南芥和黄瓜的CERK1序列为查询，从而鉴定出其他葫芦科植物中的CERK1同源基因。结果显示，这些同源基因在结构和功能上与CmCERK1和CsCERK1相似，进一步支持了CERK1在葫芦科植物中的广泛存在和保守性。同时，他们还通过构建最大似然法（Maximum Likelihood, ML）的系统发育树，分析了不同葫芦科植物中CERK1同源基因的进化关系。系统发育分析表明，CERK1在葫芦科植物中呈现出明显的分化趋势，这可能与不同物种在进化过程中对病原体的适应性有关。

总的来说，这项研究揭示了CERK1在葫芦科植物中的关键作用，并为其在植物免疫系统中的功能提供了直接的实验证据。CERK1不仅能够识别几丁质，还能够通过激活ROS生成和防御基因表达来启动免疫反应。此外，CERK1在葫芦科植物中表现出高度的保守性，这可能与其在应对病原体侵袭和维持植物健康方面的重要性有关。然而，尽管CERK1的功能已被部分揭示，仍有许多问题有待进一步研究，例如CmLYK5和CmRBOH的具体作用机制，以及CERK1在其他微生物信号识别中的潜在功能。未来的研究可以利用更先进的基因组学和蛋白质组学技术，深入探索CERK1在植物免疫和共生中的分子机制，从而为作物抗病育种和病害防控提供新的思路和方法。