综述：可变剪接：人类骨骼生物学和肿瘤进展中的关键调控因子

《Research》：Alternative Splicing: A Critical Regulator in Human Bone Biology and Tumor Progression

本文系统综述了替代剪接（AS）在骨生物学中的调控机制，包括成骨细胞分化、骨重塑及骨肿瘤（如骨肉瘤、Ewing肉瘤）进展中的作用，重点探讨了AS通过调控关键基因（如COL2A1、IGF1、RANKL）及RNA结合蛋白（如SRSF1、DDX5）影响骨代谢平衡。同时分析了AS异常在骨 metastatic癌症（如前列腺癌、乳腺癌）中的致癌机制，并总结了AS靶向治疗（如ASO、小分子抑制剂）的临床进展与挑战。

　　### 骨骼生物学中可变剪接的调控作用

可变剪接（Alternative Splicing, AS）作为转录后调控的核心机制，通过不同的剪接模式使单一基因产生多种不同的RNA和蛋白质异构体，从而显著扩展了基因表达的多样性。AS在组织分化、器官发育和疾病进展中发挥着关键作用。本综述聚焦于AS在骨骼生物学中的重要作用，特别是其对成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、骨基质重塑和骨重塑的调控，以及AS相关RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）在这些过程中的参与。我们还强调了骨骼特异性AS事件及其在骨骼发育和维持中的生理意义。此外，本综述还探讨了AS在骨相关肿瘤（如骨肉瘤、尤文氏肉瘤和软骨肉瘤）中的病理作用，以及在骨转移性癌症（如前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌）中异常AS机制的深入分析，揭示了其在肿瘤进展和骨微环境改变中的角色。综述还探讨了AS因子、信号通路和机械刺激如何协同调控骨细胞在生理和病理条件下的功能，为识别潜在干预策略提供了新的视角。此外，还总结了AS在其他病理骨条件（如骨质疏松症、骨关节炎和遗传性骨病）中的机制。

### 人类前mRNA剪接过程及其调控

人类前mRNA的剪接是由剪接体精确调控的复杂过程，涉及对剪接位点和分支点的准确识别，随后进行内含子的去除和外显子的连接。AS的调控依赖于顺式作用元件和反式作用因子，这些调控机制在骨骼生物学中发挥着关键作用。主要的细胞类型，包括成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞，其分化和功能均受到AS的调控。此外，骨基质的关键成分，如胶原蛋白和纤维连接蛋白，也受到AS的调控，影响骨组织的结构和功能。然而，目前关于骨生物学中AS的研究仍较为零散，缺乏对成骨、骨吸收和骨基质代谢的整合研究。因此，本综述系统总结了骨生物学中最近的AS进展，强调了新的机制见解和潜在的转化价值。

### 剪接过程的调控机制

在人类中，前mRNA的剪接过程涉及多个关键步骤，包括剪接体的组装、激活、催化和解聚。剪接体由多种小核RNA（snRNA）和相关蛋白组成，其中U1和U2 snRNP在剪接过程中发挥重要作用。在剪接体的组装阶段，U1 snRNP识别内含子的5′-GU序列，形成早期剪接体复合物（E-complex）并启动剪接组装。随后，剪接因子1（SF1）与内含子的分支点结合，而U2AF65-U2AF35异二聚体则与下游的多聚嘧啶区和3′剪接位点结合，形成E复合物。RNA解旋酶则通过替换SF1和U2AF，招募U2 snRNP至分支点序列，与U1 snRNP结合形成A复合物。U4/U6.U5三元snRNP随后被招募，构建预-B复合物，其中U6 snRNA与5′剪接位点配对，折叠成剪接位点。U4 snRNA则维持U6处于前催化构型。U5 snRNA则通过其环I结构将5′剪接位点的外显子与3′剪接位点的外显子对齐，促进外显子连接。在催化阶段，DHX16解旋酶重塑B复合物，使分支螺旋在分支点和5′剪接位点对接，随后催化分支反应形成B*复合物。C复合物在磷酸基团断裂后形成，而B*和C复合物在分支反应的开始和完成阶段具有相似的功能。最后，在解聚阶段，剪接体在剪接因子的作用下形成P复合物，并通过DHX15、TFP11和C2ORF3的作用，将snRNP和NTC回收至剪接循环中。

### 骨骼生物学中的AS调控

在骨骼生物学中，AS在成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的分化、功能和代谢过程中发挥重要作用。成骨细胞的AS事件主要通过调控RUNX2活性、ROS信号和机械刺激反应来控制成骨分化。例如，研究发现，在成骨细胞分化过程中，TID（由DNAJA3编码）的三种剪接变体（TID-L、TID-I和TID-S）中，TID-L和TID-I的表达水平升高，而TID-S的表达水平较低，这可能与TID-S在成骨分化中的作用有关。此外，长期的AS调控（如PNO40的剪接变体）在成骨细胞的分化过程中具有重要作用。研究还表明，骨代谢相关基因的AS在骨骼发育中起关键作用，尤其是在成骨细胞的分化和功能调控中。例如，研究发现，MAML1和SRSF5等剪接因子的剪接事件可能影响骨基质的合成和重塑。

在破骨细胞中，AS通过调控关键基因的剪接模式，影响其分化和骨吸收功能。例如，CPEB4通过液-液相分离与SRSF5和SRSF6共定位，稳定正常的剪接变体ID2-201。而在缺乏CPEB4的情况下，异常变体ID2-202和ID2-203的表达水平升高，从而影响破骨细胞的分化和功能。此外，研究还表明，AS在调控破骨细胞的生存和功能中起关键作用，特别是在RANKL（受体激活因子NF-κB配体）和Wnt/β-catenin信号通路中。AS还通过调控RANKL的剪接变体（如vRANK）影响破骨细胞的分化和骨吸收。

在软骨细胞中，AS通过调控关键基因的剪接模式，影响其分化和功能。例如，研究发现，WISP1的剪接变体WISP1v（缺乏外显子3）在软骨细胞的终末分化过程中被上调，可能与骨的形成和重塑有关。此外，IGF1的剪接变体（如IGF1Ea、IGF1Eb和IGF1Ec）在软骨细胞的分化和功能调控中起关键作用。不同剪接变体可能影响IGF1的活性和功能，从而调控软骨细胞的分化和功能。

在骨基质中，AS通过调控关键成分（如胶原蛋白和纤维连接蛋白）的剪接模式，影响骨基质的结构和功能。例如，COL2A1（胶原蛋白IIα1链）的剪接变体（如IIA、IIB、IIC和IID）在软骨细胞的分化和功能中起关键作用。此外，研究还表明，骨基质的重塑与AS密切相关，尤其是在骨肿瘤和骨转移性癌症中。AS通过调控骨基质成分的剪接模式，影响其结构和功能，从而促进或抑制骨的形成和重塑。

### AS在骨肿瘤中的病理作用

在骨肿瘤中，AS的异常模式与肿瘤的进展密切相关。例如，骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）的进展受到AS的调控，特别是在其关键基因的剪接变体（如LEPROT、CD55和IGF1）中。研究发现，OS组织中某些AS变体的表达水平显著高于正常组织，这可能与肿瘤的侵袭性和转移性有关。此外，AS还通过调控肿瘤微环境和骨转移性微环境，影响肿瘤的进展和转移。

在尤文氏肉瘤（Ewing sarcoma, EwS）中，AS的异常模式与肿瘤的进展密切相关。例如，EWS-FLI1融合蛋白的AS变体可能影响其在骨组织中的功能，从而促进肿瘤的生长和转移。此外，研究还表明，AS在EwS的进展中起关键作用，特别是在调控细胞周期和凋亡过程中。例如，SRSF1的表达水平升高可能促进EwS细胞的增殖和迁移，而其表达水平降低则可能抑制这些过程。

在软骨肉瘤（Chondrosarcoma, CS）中，AS的异常模式与肿瘤的进展密切相关。例如，ADAM28的剪接变体可能影响其在骨组织中的功能，从而促进肿瘤的生长和转移。此外，研究还表明，CS的进展与AS相关蛋白（如hnRNPM和SRSF3）的调控有关，这些蛋白可能影响CS细胞的分化和功能。

在转移性骨癌中，AS的异常模式可能促进肿瘤的转移和侵袭。例如，前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）的转移可能与AR（雄激素受体）的剪接变体（如AR-V7）有关，这些变体可能影响AR的活性和功能，从而促进肿瘤的转移和侵袭。此外，AS在乳腺癌和膀胱癌的转移中也起关键作用，可能通过调控关键基因的剪接模式影响肿瘤的进展和转移。

### AS在骨相关疾病中的应用

AS在骨相关疾病的诊断和治疗中具有潜在的应用价值。例如，通过靶向AS变体，可以开发新的治疗策略，如ASO（反义寡核苷酸）和CRISPR工具。这些方法可以用于体内模型，直接验证AS变体的功能和作用机制。此外，AS变体可能作为诊断和预后标志物，如AR-V7和COL2A1IIA/PIIANP，这些变体的检测可能帮助评估骨关节炎的进展和治疗效果。

在临床研究中，AS相关的治疗策略可能为骨相关疾病的治疗提供新的思路。例如，Denosumab通过靶向AS生成的sRANKL蛋白，阻断RANKL-RANK信号通路，从而有效抑制破骨细胞的活性。此外，通过调控AS变体，可以开发新的治疗药物，如miR-exon4，该变体通过调控RUNX2的表达，促进成骨细胞的分化和骨生成。

### 未来展望与研究方向

在未来的骨相关疾病研究中，AS的调控机制和应用潜力仍有待深入探索。首先，需要进一步研究AS在骨发育、重塑和疾病进展中的具体作用机制，特别是不同细胞类型和组织环境下的调控差异。其次，开发更精确的AS检测方法，如滴定数字PCR、长读长测序和靶向RNA捕获测序，将有助于提高AS检测的准确性和敏感性。此外，探索AS在骨免疫调控中的作用，特别是其在骨肿瘤和骨转移性癌症中的调控机制，可能为新的治疗策略提供理论依据。

在治疗策略方面，开发具有高选择性和组织特异性的AS靶向药物是未来的重要方向。例如，通过设计针对骨肿瘤微环境的纳米载体，可以实现药物的主动靶向和减少对正常组织的副作用。此外，利用PROTAC技术选择性降解AS相关蛋白，可能为AS靶向治疗提供新的思路。同时，通过计算机辅助筛选和AI预测模型，可以优化小分子抑制剂的结构和药理特性，提高其治疗效果。

综上所述，AS在骨骼生物学和相关疾病中的作用日益受到关注，其调控机制和应用潜力为未来的骨疾病研究和治疗提供了新的视角和方向。通过深入研究AS的调控网络和作用机制，可以为骨相关疾病的精准诊断和治疗奠定基础。