磺胺类药物抗性基因sul4存在于常见的废水污泥细菌中，并在多种新发现的微生物种类及其宿主体内被发现

《Microbiology Spectrum》：Sulfonamide resistance gene sul4 is hosted by common wastewater sludge bacteria and found in various newly described contexts and hosts

磺胺类抗生素耐药基因sul4在污水微生物中的宿主及遗传机制研究。通过PacBio长读测序和甲基化分析，发现sul4模块（含truncated folK、ISCR28和整合子基因）在变形菌门、放线菌门等环境微生物及沙门氏菌、弧菌等机会致病菌中广泛存在。该模块通过ISCR28转座子和整合子介导的基因水平转移，实现跨环境与临床宿主的传播，并在污水处理过程中富集。研究揭示了sul4在污水系统中的传播路径及潜在风险，强调需加强污水处理出水的耐药基因监测。

　　抗生素耐药性问题是全球公共卫生和环境科学领域关注的焦点。在20世纪30年代，第一种广谱抗生素磺胺类药物的出现，彻底改变了医学的发展进程。然而，随之而来的是磺胺类耐药基因（如sul基因）的广泛传播。尽管sul基因的早期变种sul1、sul2和sul3分别在1975年、1980年和2003年被发现，但最新的sul4基因直到2017年才首次被描述。由于sul4基因的传播范围和宿主范围尚不明确，因此对其遗传背景和传播机制的研究显得尤为重要。本研究通过PacBio长读长宏基因组测序和细菌甲基化信号，对污水中sul4基因的遗传环境及其携带细菌进行了深入分析，并扩展了对sul4携带者的描述。研究结果表明，sul4基因在污泥中广泛存在，并且被多种细菌所携带，如来自Myxococcota和Chloroflexota门的物种，以及Trichlorobacter和Desulfobacillus属的细菌，这些细菌在活性污泥中较为常见。此外，sul4基因已传播到多种机会性人类病原菌中，如Aeromonas和Moraxella，以及之前已知的Salmonella。sul4基因周围的序列包括一个截断的folK基因和一个ISCR28元件，并且在所有研究序列中显示出高度的保守性。同时，该模块与多种整合子整合酶基因相关联，还检测到了其他可能增加sul4基因移动性的移动相关元件。总体而言，sul4基因在不同进化分支中的宿主细菌显示出高效的基因转移能力，表明其在临床和环境细菌之间的传播潜力。研究还指出，污水可能为这种水平基因转移提供了有利的环境条件。

sul4基因在污水样本中被检测到，除了一个样本外，所有样本中均发现其存在。大多数宏基因组读段映射到sul4基因来源于污泥样本，而来自进水和出水的读段较少。此外，只有污泥的宏基因组组装中可以获取到包含sul4基因的contigs。sul4基因的平均长度从8,636 bp到1,884,747 bp不等。使用两种不同的组装器hifiasm和metaFlye，分别构建了4个和7个包含sul4基因的contigs。根据plasX和geNomad的分析，只有其中一个contig（contig_s43139.ctg070500l）显示出类似质粒的特性，并且仅由geNomad识别。然而，该contig的长度较短，可能影响了质粒预测算法的准确性。

在污水样本中，sul4基因的遗传环境表现出多样性，其中一些序列在更广泛的遗传背景下显示出相似性。通过分析10 kb上下游区域，所有sul4序列的遗传环境均被可视化。除了高度保守的sul4模块外，其他更广泛的遗传环境则表现出更多的变化，并可以分为三个主要类别（I–III），每个类别中的基因内容显示出高度相似性。具体而言，类别I和II中的序列显示出中等相似性，从而被进一步细分为子类别IA-B和IIA-B。其余的遗传环境则要么是独特的，要么太短，无法归类为任何类别I–III的一部分。这些结果表明，sul4基因的传播和宿主范围具有一定的多样性，但核心结构仍然保持高度一致。

在sul4模块中，整合子整合酶基因的序列显示出细微的变异。整合酶基因被分为六个主要簇，并且每个簇都与参考整合酶基因显示出一定的相似性。其中，Desulfobacillus sp008933825（Ga0212071_131）的整合酶基因显示出与其它整合酶不同的特征。在类别I中，整合酶基因与Geobacter sulfurreducens的参考基因相似，而在类别II中，整合酶基因与Trichlorobacter ammonificans的参考基因相似。类别III中的整合酶基因则与来自一个进水样本和Moraxella osloensis的参考基因相似。这些结果表明，整合酶基因在不同宿主中的序列变异可能与基因传播和宿主适应性有关。

sul4模块中的ISCR28元件在几乎所有研究的sul4模块中被检测到，并且显示出与ISCR20和典型IS91样元件不同的特征。ISCR28元件由于其包含oriIS和terIS序列，并通过滚环复制机制，能够将自身及其邻近的基因转移到新的环境和宿主中。值得注意的是，Yuan和同事的研究表明，当oriIS和terIS序列完整时，ISCR28元件在遗传环境中的变化较大，而当oriIS不完整时，其遗传环境则保持高度保守。这表明，在某些情况下，ISCR28可能作为被动元件，与其他移动遗传元件共同传播。在本研究中，所有sul4模块中的ISCR28均具有完整的oriIS序列，并且在多种遗传背景和宿主细菌中存在，这支持了其在当前环境中的移动性。此外，大多数ISCR28元件后方均检测到attC位点，表明这些元件可能作为整合子基因盒的一部分被动转移。

除了ISCR28元件，还检测到了其他类型的IS元件，这些元件可能在sul4基因的传播中起到关键作用。这些IS元件的多样性表明，广泛的IS元素可能促进了sul4基因在不同宿主中的传播。然而，由于这些序列出现在携带sul4基因的质粒中，它们可能作为质粒传播过程中的被动成分。尽管我们发现整合酶和ISCR28元件可能在sul4模块的传播中起作用，但其确切机制仍需进一步研究。

在污水样本中，sul4基因的携带菌被发现来自不同的生态位和分类群，包括Myxococcota、Desulfobacterota和Chloroflexota门的物种。这些门的细菌在土壤和各种水生环境中广泛存在，例如海洋和淡水生态系统以及污水。它们以其多样的代谢能力和参与多种营养循环而闻名。例如，Trichlorobacter ammonificans在硝酸盐还原过程中起着重要作用，而Myxococcota的细菌则因其捕食性而被广泛研究。这些细菌之间的紧密接触可能促进了sul4基因在微生物群落中的水平传播。

此外，我们还发现了其他常见的污水细菌，如Sphingobium yanoikuyae和Desulfobacillus sp008933825，它们也是sul4基因的携带者。Sphingobium yanoikuyae的质粒中发现的sul4基因可能有助于其快速适应新的环境压力。同时，该模块中的氨基糖苷核糖开关可能调节ARG的表达，以响应氨基糖苷抗生素，并可能整合更多的整合子编码基因盒。然而，目前尚未在该位置检测到其他ARG。

在污水样本中，sul4基因的携带细菌包括来自不同门的物种，这些细菌可能在污水处理过程中促进sul4基因的传播。特别是，Myxococcota、Desulfobacterota和Chloroflexota门的细菌被发现是sul4基因的重要携带者。这些细菌不仅在污水处理中发挥重要作用，还在多种环境条件下具有高度的适应性。因此，研究这些细菌在污水处理中的作用，有助于更好地理解sul4基因的传播机制和潜在风险。

此外，我们还发现了一些与sul4基因相关的病原菌，如Aeromonas和Moraxella。这些病原菌的sul4基因可能通过质粒传播，这表明sul4基因的传播途径具有多样性。例如，Peng和同事的研究表明，sul4基因在Salmonella enterica的染色体中整合，这可能是通过与质粒的基因组混合实现的。同时，我们还发现了其他病原菌的sul4基因，这些基因可能通过整合子基因盒进行传播，从而增加sul4基因的传播速度。

本研究的发现表明，sul4基因的传播不仅限于临床环境中，还广泛存在于污水处理系统中。污水收集了整个污水系统中所有人口的粪便和肠道微生物，这使得污水中的耐药基因组（resistome）能够反映临床报告中的耐药模式，并捕捉不同人群中的时空变化。污水处理过程中，不同处理阶段的微生物群落组成和多样性会影响耐药基因的分布。例如，整合子整合酶基因在污水处理厂的出水口比在进水中更为常见，这反映了细菌对环境压力的响应。然而，有效的污水处理系统虽然能够去除大部分细菌和耐药基因，但某些耐药基因可能因宿主细菌的增殖而被富集，甚至可能进入污水处理厂的排放物中。

在污水处理过程中，不同处理阶段的耐药基因组表现出显著的差异。活性污泥在污水处理中起着关键作用，因为它能够通过多种生化过程去除营养物质。然而，关于ARGs和整合子整合酶基因在处理过程中的去除与富集现象，存在不同的研究结果。一些研究表明，这些基因在处理过程中可能被富集，而不是被去除。这种富集可能与环境压力和处理条件的变化有关，例如抗生素的存在和微生物群落的改变。因此，研究污水处理过程中耐药基因的传播和富集机制，对于评估这些基因的潜在风险至关重要。

通过利用PacBio长读长测序和独特的细菌甲基化模式，我们能够更准确地识别sul4基因的携带细菌。在所有sul4基因的contigs中，平均检测到六种甲基化模式，包括m6A和m4C类型。这些甲基化模式的多样性表明，sul4基因可能被不同种类的细菌携带。其中，GATC是最常见的甲基化模式，出现在六个sul4 contigs中。此外，我们还发现了一些独特的甲基化模式，这些模式可能与特定的细菌种类相关。这些结果表明，通过甲基化信号进行基因组分组可以有效地识别sul4基因的携带细菌，并且有助于理解这些基因的传播机制。

综上所述，本研究揭示了sul4基因在污水处理系统中的广泛传播和多样性宿主。sul4基因不仅被不同的细菌种类携带，还通过整合子整合酶和ISCR28元件等移动遗传元件进行传播。这些发现表明，污水处理系统可能成为sul4基因传播的重要途径，同时也为评估抗生素耐药性的风险提供了新的视角。未来的研究需要进一步探讨这些移动遗传元件在sul4基因传播中的具体作用，并评估污水处理过程中耐药基因的富集和传播机制。此外，污水处理厂的排放物中可能存在sul4基因及其携带细菌，这可能对环境和人类健康构成潜在威胁。因此，对污水处理厂排放物中的耐药基因进行监测和评估，对于防止抗生素耐药性的进一步扩散具有重要意义。