氨苄西林通过c-di-GMP调控的BpfAGD系统促进腐生沙雷氏菌（Shewanella putrefaciens）的生物膜形成

《Microbiology Spectrum》：Ampicillin promotes the biofilm formation of Shewanella putrefaciens through the c-di-GMP-regulated BpfAGD system

β-内酰胺类抗生素对Shewanella菌的生物膜形成具有双重作用：青霉素类（如氨苄西林）促进Shewanella putrefaciens CN32和Shewanella oneidensis MR-1的生物膜形成，而头孢菌素、碳青霉烯和单环菌素则抑制。机制研究表明，氨苄西林通过调控16个c-di-GMP代谢酶（如DosD、BpfAGD系统）增加胞内c-di-GMP水平，促进生物膜形成。研究还发现不同Shewanella菌种对同一类抗生素的反应存在差异。

　　生物膜是微生物在特定条件下形成的一种结构化的附着群体，其核心由细菌细胞分泌的胞外聚合物物质（EPS）构成，包括多糖、蛋白质和DNA等成分。这些生物膜不仅为细菌提供了抵御外界不良环境的保护，还显著增强了它们对各种应激因素的抗性。由于生物膜中的细菌对抗生素的耐药性远高于游离状态的细菌，因此，研究抗生素对生物膜形成的影响已成为微生物学领域的重要课题之一。特别是在临床和工业环境中，抗生素诱导的生物膜形成可能会加剧感染的持续性与治疗难度，从而对公共卫生和生产安全构成挑战。

本研究聚焦于β-内酰胺类抗生素对两种重要革兰氏阴性菌——*Shewanella putrefaciens* CN32和*S. oneidensis* MR-1——生物膜形成的影响。尽管许多*Shewanella*菌株天然对某些β-内酰胺类抗生素具有耐药性，但关于这些抗生素是否能诱导生物膜形成的系统性研究仍较为有限。通过系统分析不同β-内酰胺类抗生素对这两种菌株的生物膜形成的影响，本研究揭示了抗生素类型与生物膜形成之间的复杂关系，并探讨了其可能的分子机制。

研究结果表明，六种青霉素类抗生素均能显著促进*S. putrefaciens* CN32的生物膜形成，而另外三种β-内酰胺类抗生素——头孢菌素类、碳青霉烯类和单酰胺类——则抑制其生物膜形成。这一现象可能与青霉素类抗生素对细菌细胞壁合成的干扰有关，这种干扰可能触发了细菌的应激反应，进而促进了生物膜的形成。具体而言，青霉素类抗生素能够通过调节16种DGCs/PDEs（二元组氨酸/天冬氨酸激酶结构域蛋白）的活性，进而影响细胞内c-di-GMP（环二鸟苷酸）的水平。c-di-GMP作为细菌生物膜形成的关键信号分子，其浓度的升高会促进生物膜的形成，同时抑制细菌的游动能力。因此，青霉素类抗生素通过调控c-di-GMP的合成与降解，从而影响了*S. putrefaciens* CN32的生物膜形成过程。

此外，研究还发现，这些青霉素类抗生素同样能够促进*S. oneidensis* MR-1的生物膜形成，而头孢菌素类和单酰胺类抗生素则表现出抑制作用。值得注意的是，碳青霉烯类抗生素在*S. oneidensis* MR-1中表现出促进生物膜形成的独特效果。这说明不同类型的β-内酰胺类抗生素对*Shewanella*属细菌的生物膜形成具有不同的调控机制。*S. oneidensis* MR-1含有98种预测的c-di-GMP代谢酶，远多于*S. putrefaciens* CN32中的47种。因此，这种差异可能与碳青霉烯类抗生素在*S. oneidensis* MR-1中引发的更复杂的生物膜调控网络有关。

为了进一步揭示青霉素类抗生素如何调控生物膜形成，研究选择了ampicillin作为主要研究对象。通过分析不同浓度的ampicillin对*S. putrefaciens* CN32的影响，发现其能够显著提高细菌的生物膜形成能力，同时抑制游动能力。这些结果提示，ampicillin可能通过调控c-di-GMP的合成与降解，从而影响生物膜相关蛋白的表达和功能。例如，ampicillin的加入导致BpfA（一种细胞膜表面附着蛋白）的表达增加，同时增强了BpfD与BpfG之间的相互作用，这可能是通过c-di-GMP的积累来实现的。这种调控机制与BpfAGD系统密切相关，该系统是*Shewanella*生物膜形成的重要调控因子。

然而，研究中也发现了一些矛盾的现象。例如，某些DGCs/PDEs虽然含有EAL结构域，理论上应作为PDE（磷酸二酯酶）发挥作用，但在ampicillin的作用下，这些蛋白反而可能促进了生物膜的形成。这表明，DGCs/PDEs的功能可能不仅限于c-di-GMP的合成或降解，还可能通过其他机制参与生物膜的调控。此外，某些DGCs/PDEs的表达水平在ampicillin作用下发生显著变化，但其对生物膜形成的影响却并不明显，这提示这些蛋白可能在其他生理过程中发挥作用，而非直接参与生物膜的调控。

进一步的实验表明，ampicillin能够通过调节16种DGCs/PDEs的活性，从而影响*S. putrefaciens* CN32的生物膜形成。这些蛋白中，某些含有GGDEF结构域，可能具有DGC活性，而另一些含有EAL或HD-GYP结构域，可能具有PDE活性。然而，实验结果显示，ampicillin对这些蛋白的调控主要发生在翻译后或转录后阶段，而非直接改变其基因表达水平。这提示，抗生素可能通过影响这些蛋白的活性，而非其表达量，来调控生物膜的形成。例如，某些DGCs/PDEs的表达在ampicillin存在时并未发生显著变化，但其活性却显著增强或减弱，这表明抗生素可能通过其他方式，如蛋白修饰或结构改变，来调控这些酶的活性。

此外，研究还发现，某些DGCs/PDEs的基因缺失会导致生物膜形成受到抑制，即使在ampicillin存在的情况下也是如此。这表明，这些蛋白在生物膜形成中扮演着关键角色，其功能可能与c-di-GMP的合成或降解密切相关。例如，Δ*pdeB*和Δ*lrbR*突变株在ampicillin作用下表现出更高的生物膜形成能力，这可能是由于PdeB和LrbR的缺失导致细胞内c-di-GMP水平升高，从而促进了生物膜的形成。然而，某些突变株的生物膜形成能力并未因ampicillin的加入而显著改变，这提示这些蛋白可能在生物膜形成中并非核心调控因子，或者其调控机制更为复杂。

值得注意的是，某些DGCs/PDEs的基因缺失并未显著影响生物膜形成，这可能与它们在生物膜形成中的次要作用有关。例如，Δ*0133*、Δ*2830*和Δ*0814*突变株在ampicillin作用下生物膜形成能力的变化并不显著，这表明这些蛋白可能在其他生理过程中发挥作用，而非直接参与生物膜的调控。因此，尽管ampicillin能够通过调控多种DGCs/PDEs来影响生物膜形成，但其作用机制可能涉及多个层次，包括直接调控c-di-GMP水平、间接影响生物膜相关蛋白的表达，以及通过其他生理过程的改变来间接调控生物膜的形成。

本研究还揭示了不同β-内酰胺类抗生素对*S. oneidensis* MR-1生物膜形成的影响。结果显示，所有六种青霉素类抗生素均能显著促进该菌株的生物膜形成，而两种头孢菌素类抗生素和一种单酰胺类抗生素则表现出抑制作用。此外，两种碳青霉烯类抗生素也能促进*S. oneidensis* MR-1的生物膜形成。这一发现提示，β-内酰胺类抗生素对*Shewanella*属细菌的生物膜形成具有不同的调控效果，这可能与不同抗生素的化学结构及其对细菌细胞壁合成的影响程度有关。

综上所述，本研究为理解β-内酰胺类抗生素如何影响*Shewanella*属细菌的生物膜形成提供了重要的理论基础。青霉素类抗生素通过调节c-di-GMP代谢酶的活性，进而影响生物膜相关蛋白的表达和功能，从而促进生物膜的形成。而头孢菌素类、单酰胺类和某些碳青霉烯类抗生素则表现出抑制作用。这一发现不仅有助于揭示β-内酰胺类抗生素在微生物学中的复杂作用，也为抗生素的合理使用和生物膜控制提供了新的思路。未来的研究需要进一步探讨不同β-内酰胺类抗生素对生物膜形成的具体调控机制，以及这些机制在不同*Shewanella*菌株中的差异。此外，还需研究这些抗生素是否能够通过其他途径影响生物膜的形成，例如通过改变细菌的代谢途径或调控其他信号分子的活性。这些研究将有助于开发更有效的抗生素使用策略，以减少生物膜的形成和耐药性的产生。