一种胞质锌捕获蛋白增强了淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）对营养免疫的抵抗力

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：A periplasmic zinc capture protein enhances the resistance of Neisseria gonorrhoeae to nutritional immunity

淋病奈瑟菌在锌受限条件下通过DUF4198家族蛋白Zcp维持锌稳态，促进外膜完整性和感染能力，Zcp不参与锌转运而通过锌缓冲辅助其他转运蛋白工作。

　　在病原体感染过程中，宿主通过限制关键金属如锌的可用性来削弱病原体的生长，这种机制被称为营养性免疫。病原体为了对抗这种限制，会表达特定的基因产物，以增强其在金属缺乏环境中的生存能力。在这些病原体中，淋病奈瑟菌（*Neisseria gonorrhoeae*，以下简称Gc）表现出对锌限制的强烈反应，其中最显著的基因之一是*ngo1049*，该基因编码一种属于DUF4198蛋白家族的蛋白，被命名为Zcp（锌捕获蛋白）。DUF4198蛋白家族广泛存在于革兰氏阴性细菌中，但其具体功能长期以来未被明确。本研究首次对DUF4198蛋白进行了结构、生化和功能方面的系统分析，揭示了Zcp在Gc中发挥的关键作用，特别是在锌限制条件下维持细胞膜完整性以及促进感染能力。

锌在细菌生理过程中具有重要作用，不仅是许多酶的辅因子，还参与了代谢、蛋白质合成和繁殖等核心过程。然而，锌的过度积累也可能导致蛋白质错配，从而引发细胞毒性。因此，细菌进化出复杂的系统来确保锌的生物可利用性，同时避免过量积累。在感染过程中，宿主释放的锌结合蛋白如S100A8/A9（称为calprotectin）和S100A7（称为psoriasin）能够显著降低病原体的生长能力。但Gc等病原体已经发展出专门的机制来对抗这种限制，例如通过表达TonB依赖性转运蛋白TdfH和TdfJ，分别从宿主的calprotectin和psoriasin中提取锌。这些转运蛋白对人类蛋白具有高度选择性，而非其他动物来源的蛋白。随后，锌被运送到细胞膜上的ZnuB渗透酶，并与细胞质中的ZnuC ATP酶协同完成锌的摄入过程。锌的摄入调控因子Zur则控制这些基因及其他响应锌限制的基因的表达。

在锌缺乏条件下，病原体通常会分泌一些辅助蛋白，以增强金属的获取并维持细胞功能。例如，大肠杆菌（*Escherichia coli*）和沙门氏菌（*Salmonella enterica*）能够分泌ZinT，这是一种由Zur调控的锌结合蛋白，可以与ZnuA形成稳定的复合物，从而促进锌的摄入。类似地，*Paracoccus denitrificans*产生一个次要的ABC转运系统AztCBA，其辅因子AztD也是一种锌结合蛋白。*Pseudomonas aeruginosa*则具有三种额外的锌摄入系统。除了这些获取系统，一些革兰氏阴性细菌如*Acinetobacter baumanii*和*Vibrio cholerae*还产生由Zur调控的金属酶，这些酶能够重塑肽聚糖结构，以增强细胞膜的完整性。然而，关于锌在细胞膜中的分配机制，尤其是如何确保锌能够被细胞膜所需的金属蛋白正确结合，目前尚不清楚。相比之下，铜的细胞膜分配已有明确的铜结合蛋白（铜载体蛋白）作为缓冲和运输的中介，但锌的类似机制尚未被定义。

Zcp在Gc中被发现是锌和Zur调控的细胞膜蛋白。通过基因组分析，Zcp的编码基因*ngo1049*被证实为单顺反子基因，其上游存在一个Zur调控元件（Zur box）。当Gc在含有锌螯合剂TPEN的培养基中培养时，Zcp的表达显著上调，而在锌浓度足够时，其表达则被抑制。此外，Zur缺失的Gc突变株中，Zcp的表达水平不受锌浓度影响，这表明Zcp的表达依赖于Zur的调控。通过Western blot分析，Zcp在金属缺乏的培养基中被检测到，而在金属丰富的培养基中则被抑制。Zcp的表达不仅受锌调控，而且其结构具有高度的可溶性，不会出现在细胞膜或细胞质中。这种特性表明，Zcp主要在细胞膜空间中发挥作用。

通过X射线晶体学技术，Zcp的结构被解析为一个同源二聚体，每个亚基都包含一个锌结合位点，该位点由三个组氨酸残基（H29、H31和H142）组成。该结合位点具有约0.31微摩尔的亲和力，表明Zcp对锌具有较高的选择性。Zcp的二聚体结构在动态光散射（DLS）和尺寸排阻色谱-小角X射线散射（SEC-SAXS）分析中得到了验证，其分子量约为63千道尔顿，对应的二聚体形式。Zcp在锌缺乏条件下形成稳定的结构，而锌的存在可能会影响其构象变化，从而影响其功能。此外，Zcp在锌缺乏时表现出更高的热稳定性，其熔点为44.3°C，而无锌形式的熔点为43.1°C，进一步支持了其对锌的结合能力。

Zcp不仅在Gc中具有重要功能，在其他革兰氏阴性细菌中也广泛存在。通过序列相似性网络（SSN）分析，Zcp与多种DUF4198蛋白形成两个不同的簇，其中Cluster 1包含Zcp的锌结合组氨酸残基，而Cluster 2则具有一个延长的组氨酸富集的C端尾部。这些不同簇的蛋白可能具有不同的金属结合特性，Zcp作为Cluster 1的代表，主要负责锌的捕获和分配，而Cluster 2的蛋白可能在其他金属的处理中发挥重要作用。进一步的生化和功能分析表明，Zcp并不直接参与锌的摄入，而是通过缓冲细胞膜中的锌，支持锌依赖的细胞膜蛋白的正确金属化，从而维持细胞膜的完整性。

为了验证Zcp的功能，研究人员构建了Zcp缺失的Gc突变株，并在锌缺乏条件下观察其生长和感染能力。结果表明，Zcp缺失的菌株在锌缺乏的环境中表现出显著的生长缺陷，但在锌补充后恢复至正常水平。此外，Zcp在感染人类上皮细胞和中性粒细胞时对病原体的存活具有重要作用。特别是在中性粒细胞中，Zcp缺失的菌株对过氧化氢（H?O?）表现出更高的敏感性，这表明Zcp可能通过维持细胞膜中的锌水平，间接增强了病原体对氧化应激的抵抗力。同时，Zcp还与一些细胞膜相关蛋白如BAM复合体的亚基以及金属酶结合，这进一步支持了其在维持细胞膜完整性中的作用。

研究还发现，Zcp在锌缺乏时被大量表达，并且其表达水平与Zur的调控密切相关。Zur缺失的Gc突变株中，Zcp的表达不受锌浓度影响，这说明Zur是Zcp表达的关键调控因子。此外，Zcp的表达在不同的细菌环境中表现出高度的适应性，例如在缺乏锌的培养基中，Zcp的表达被显著上调，而在锌丰富的培养基中则被抑制。这种表达模式可能反映了细菌对锌环境的动态响应，确保在锌缺乏时能够迅速调整其代谢策略。

在感染模型中，Zcp对Gc的感染能力有显著影响。当Gc在含有calprotectin的培养基中培养时，Zcp缺失的菌株表现出显著的生长缺陷，而锌补充则能够恢复其生长能力。这表明Zcp在锌缺乏条件下对Gc的生存至关重要。同时，在中性粒细胞的吞噬过程中，Zcp缺失的菌株被清除的速度显著加快，尤其是在游离状态下（即脱离细胞表面的菌株）更为明显。这说明Zcp可能在维持Gc与宿主细胞的相互作用中发挥关键作用，帮助其在宿主免疫系统中存活。

综上所述，Zcp是一种在锌缺乏条件下由Gc分泌的蛋白，其主要功能是通过缓冲细胞膜中的锌，确保锌依赖的细胞膜蛋白的正确金属化，从而维持细胞膜的完整性。这一机制不仅帮助Gc在宿主的营养性免疫下生存，还可能增强其在感染过程中的适应能力。此外，Zcp的表达和功能可能与其他金属如铜、镍和钴有关，但这些金属在Gc的生存环境中并不常见，因此Zcp主要在锌的调控中发挥作用。研究还表明，Zcp的结构和功能在不同的革兰氏阴性细菌中具有一定的保守性，提示这一蛋白可能在更广泛的病原体中具有相似的生物学意义。未来的研究将进一步探讨Zcp与其他金属的相互作用，以及其在不同宿主环境中的适应机制。