Pol θ和Pol δ之间的DNA协同转移在双链断裂修复过程中重新决定了微同源序列的选择

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Coordinated transfer of DNA between Pol θ and Pol δ resets microhomology choice during double-strand break repair

DNA双链断裂修复中Pol θ与Pol δ协作机制研究。Pol δ以逐核苷酸方式切除单链DNA末端的未配对碱基，随后转移至Pol θ启动末端连接。Pol θ的DNA结合依赖性ATP酶活性解除RPA抑制，其POL域的三个 primer-grasp残基（K2181/R2202/R2254）对内部微同源锚定至关重要。研究揭示了Pol δ外切酶与Pol θ协同完成TMEJ修复的分子步骤及结构基础。

　　DNA双链断裂（DSB）是DNA损伤中最严重的类型之一，能够引发染色体断裂、基因组不稳定以及细胞死亡等后果。在正常细胞中，DSB主要通过同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种机制进行修复。然而，在某些癌细胞中，由于HR功能的缺陷，TMEJ（DNA聚合酶θ介导的末端连接）成为一种重要的替代修复方式。TMEJ利用微同源序列（MH）进行修复，这使得它在HR缺陷的癌细胞中尤为重要。因此，理解TMEJ的分子机制不仅有助于揭示DNA修复的基本原理，还可能为癌症治疗提供新的思路。

DNA聚合酶θ（Pol θ）在TMEJ中扮演关键角色，其结构包括一个与聚合酶结构域（POL）相连的螺旋酶样结构域（HLD）和一个主要由无序结构组成的中央结构域（cen）。Pol θ的HLD不仅具有ATP酶活性，还具备“捕获”单链DNA（ssDNA）的能力，能够将两个ssDNA尾端拉近，促进它们在MH处配对。这一过程对于TMEJ的启动至关重要。同时，Pol θ的ATP酶活性还可以解除RPA对ssDNA的保护作用，从而为MH的识别和连接创造条件。RPA是细胞中迅速结合并保护ssDNA的关键蛋白，它会阻止微同源序列的自发配对，因此，Pol θ的ATP酶功能在TMEJ中具有独特的调控作用。

在TMEJ的启动阶段，Pol δ的3′到5′外切酶活性被发现对去除未配对的单链DNA末端起着重要作用。与Pol θ不同，Pol δ的外切酶活性可以逐步移除单个核苷酸，而不是一次性切割一个未配对的“ flap”（即一个较大的DNA片段）。这一过程表明，Pol δ在TMEJ中可能通过“单核苷酸移除”来准备DNA末端，然后将处理后的DNA传递给Pol θ，从而启动新的MH搜索。这一发现对于理解TMEJ中不同聚合酶之间的协作具有重要意义，因为Pol δ的外切酶活性和Pol θ的聚合酶活性在修复过程中形成一种动态的“切换”机制。

研究进一步表明，Pol δ的外切酶活性对MH的选择具有显著影响。当Pol δ去除1到4个核苷酸后，Pol θ会选择一个新的MH进行连接。这种机制与Pol δ的外切酶活性有关，同时也可能受到其聚合酶活性的影响。然而，研究发现，即使在没有Pol δ聚合酶活性的情况下，外切酶功能仍然可以促进TMEJ的启动。这意味着Pol δ在TMEJ的初始阶段主要负责DNA末端的逐步修剪，而其聚合酶活性则可能在后续的DNA合成过程中发挥作用。这种“先修剪、再连接”的模式，为TMEJ的高效进行提供了基础。

此外，研究还发现，Pol θ的中央结构域（cen）在与Pol δ的相互作用中可能起到桥梁作用。虽然cen区域本身缺乏明确的结构，但它可能通过其长度和动态特性影响Pol δ与Pol θ之间的信息传递。这提示我们，Pol θ的结构特征可能在协调两种聚合酶的功能中发挥关键作用。例如，Pol δ在移除末端核苷酸后，可能通过cen结构域将处理后的DNA传递给Pol θ，从而实现TMEJ的继续。这种结构上的协调可能确保了DNA末端的准确识别和连接。

在实验中，研究者通过体外重组的方式验证了Pol δ和Pol θ在TMEJ中的协同作用。他们利用带有荧光标记的DNA寡核苷酸模拟DSB环境，并通过电泳和DNA测序分析TMEJ的产物。实验结果表明，Pol δ的外切酶活性能够有效去除末端核苷酸，而Pol θ则能够在这些被处理后的DNA末端找到合适的MH进行连接。这一过程与RPA的抑制作用密切相关，因为RPA的存在会显著降低TMEJ的效率，而ATP的加入则能够解除这种抑制。因此，ATP不仅是Pol θ HLD功能的一部分，还可能通过影响RPA与DNA的相互作用来调控TMEJ的启动。

研究还揭示了Pol θ的某些特定氨基酸残基在TMEJ中的重要性。这些残基位于Pol θ的聚合酶结构域中，被称为“引物握持”残基。它们能够与引物的磷酸骨架相互作用，从而帮助Pol θ从内部的MH开始DNA合成。在Pol θ的结构中，这些残基是独特的，且未在其他A型DNA聚合酶中发现。这一发现表明，Pol θ的结构设计使其能够高效地从短的、可能含有错配的MH开始合成，而其他DNA聚合酶则无法实现这一功能。这为TMEJ的高保真性与低保真性之间的差异提供了分子层面的解释。

在TMEJ的体外重组实验中，研究人员还发现，Pol δ的外切酶活性并不总是主导DNA末端的修剪过程。在某些情况下，Pol θ本身也可以执行末端修剪，尤其是在缺乏Pol δ的情况下。然而，Pol θ的外切酶活性较弱，因此在TMEJ的初始阶段，Pol δ的外切酶功能仍然是不可或缺的。这一结果进一步支持了Pol δ在TMEJ中扮演“先驱者”的角色，即在Pol θ能够开始DNA合成之前，先对DNA末端进行必要的修剪。

研究还探讨了Pol δ的外切酶活性如何影响MH的选择。当Pol δ移除不同数量的核苷酸后，Pol θ会根据新的末端选择不同的MH进行连接。这种机制使得TMEJ能够在DNA末端存在多种可能的情况下，动态调整连接位置。这不仅提高了修复的灵活性，还可能减少错误连接的风险。然而，由于Pol δ的外切酶活性是非过程性的，即每次只能移除一个核苷酸，因此需要多次循环才能完成末端的充分修剪。这一过程可能需要Pol δ和Pol θ之间的频繁交互，从而确保DNA修复的连续性和准确性。

此外，研究还发现，Pol θ的HLD具有两种不同的功能：一种是ATP酶活性，用于解除RPA对ssDNA的保护；另一种是“strand capture”（链捕获）功能，用于将两个ssDNA尾端拉近，以便在MH处进行配对。这两种功能在TMEJ的启动阶段相互配合，共同完成DNA末端的识别和连接。例如，Pol θ的HLD能够通过ATP酶活性改变ssDNA的构象，使其更容易被Pol δ的外切酶处理，而随后的“strand capture”功能则有助于Pol θ找到合适的MH进行连接。这种协同作用可能解释了为什么Pol θ能够在HR缺陷的细胞中发挥关键作用。

研究还涉及了其他因素对TMEJ的影响。例如，RPA的抑制作用在没有ATP的情况下尤为明显，而ATP的加入则能够显著缓解这种抑制。这一发现表明，ATP不仅是Pol θ HLD功能的一部分，还可能在TMEJ的整个过程中起到调控作用。同时，研究者还发现，Pol δ的外切酶活性在高浓度RPA存在时会受到抑制，这可能限制了其在TMEJ中的作用。因此，TMEJ的启动可能需要在适当的ATP浓度下进行，以确保Pol δ能够有效去除未配对的核苷酸，为Pol θ的连接提供合适的条件。

综上所述，TMEJ是一个复杂的DNA修复过程，涉及多种酶的协同作用。Pol δ的外切酶活性在初始阶段对DNA末端的修剪至关重要，而Pol θ的聚合酶活性则负责后续的DNA合成。ATP酶活性和“strand capture”功能在Pol θ的HLD中起到关键作用，能够解除RPA对ssDNA的保护并促进两个ssDNA尾端的接近。此外，Pol θ的特定氨基酸残基在识别和连接MH方面也具有重要作用。这些发现不仅加深了我们对TMEJ机制的理解，还为未来研究DNA修复与癌症治疗提供了新的方向。