Platynereis dumerilii 幼虫的冷冻保存

《Cryobiology》：Cryopreservation of Platynereis dumerilii larvae

Platynereis dumerilii幼虫的冷冻保存研究首次建立了适用于该物种的协议，通过5% Me2SO和0.1%蔗糖配比，冷却速率2.5°C/min，解冻水温18°C，使6-8日龄幼虫存活率高达34%，平均8.69±13.08%，成功存活至成体并繁殖。

　　在科学研究中，许多模型生物因其独特的生物学特性和研究价值而被广泛使用。其中，海洋环节动物*Platynereis dumerilii*因其在发育生物学、进化生物学、神经生物学以及节律研究中的重要性，逐渐成为研究的重点对象。随着研究的深入，科学家们不断发现该物种在揭示生物发育机制、遗传多样性以及环境适应性方面的潜力。然而，随着研究规模的扩大，实验室中需要维持和繁殖的遗传变异体数量也在迅速增加，这给传统的活体培养方式带来了巨大挑战。因此，开发一种有效的冷冻保存技术，以替代或补充活体培养，成为当前研究的重要方向。

冷冻保存技术能够为生物材料提供长期稳定的储存条件，不仅减少了对持续活体培养的依赖，还能有效应对实验室环境变化、污染风险以及资源消耗等问题。通过冷冻保存，研究人员可以确保遗传资源的长期可用性，同时提高实验的可重复性和结果的稳定性。对于像*Platynereis dumerilii*这样具有复杂生命周期和高遗传多样性需求的物种来说，冷冻保存技术的建立尤为重要。这项研究的目的是为*Platynereis dumerilii*的幼虫开发一种可行的冷冻保存方法，确保其在复苏后能够正常发育并最终达到成年阶段，从而实现对这一重要模型生物的生物资源库建设。

本研究首次成功建立了*Platynereis dumerilii*幼虫的冷冻保存方案。该方案的核心在于优化冷冻保护剂（Cryoprotectant, CPA）的浓度、作用时间以及冷冻和解冻的温度梯度。实验表明，6至8天龄的幼虫在冷冻保存后具有最高的存活率。冷冻保护剂的配比为5%（体积比）的二甲基亚砜（Me2SO）与0.1%（质量/体积比）的蔗糖混合液，幼虫在该保护剂中进行约1小时的平衡处理后，再以2.5°C/min的速度冷却至?35°C，随后迅速转移至液氮中进行长期保存。解冻过程则在18°C的水浴中进行，持续20至30秒。复苏后的幼虫采用了一种改进的饲养方案，包括50%的绿藻*Tetraselmis marina*与50%的硅藻*Grammatophora marina*和*Nitzschia laevis*混合饲料，以及每周一次的商业饲料PlanktoMarin。此外，当幼虫开始形成管状结构时，还会提供少量切碎的有机菠菜作为补充食物。

实验结果显示，这种优化后的冷冻保存方案显著提高了幼虫的存活率。在5个月的观察期内，最高存活率达到34%，而平均存活率约为8.69%±13.08%。值得注意的是，存活率在不同批次之间存在较大波动，这可能与供体幼虫的个体差异、冷冻保存过程中的微小技术变化以及环境条件的细微差异有关。尽管如此，该方案仍然实现了幼虫的长期存活，并能够使其发育至成年阶段，甚至部分个体成功繁殖，产生了可存活的后代。这一成果不仅为*Platynereis dumerilii*的冷冻保存提供了可行的路径，也为其他环节动物的生物资源库建设提供了参考。

在实验过程中，研究人员首先对不同类型的冷冻保护剂进行了毒性测试，以确保其对幼虫的无害性。测试结果显示，使用1.4M浓度的Me2SO、乙二醇（EG）或丙二醇（PG）处理幼虫3分钟后，其在一周内的死亡率并未显著增加，说明这些保护剂在短期内对幼虫没有明显的毒性。然而，当这些保护剂与幼虫进行冷冻保存后，存活率在不同时间点表现出显著下降。例如，使用Me2SO处理的幼虫在冷冻保存后，最初存活率可达80%，但仅在第6天后逐渐降低，最终在第8天时全部死亡。这表明，虽然冷冻保护剂在短时间暴露下是安全的，但其在冷冻保存过程中的作用可能受到多种因素的影响，包括冷冻速率、解冻温度以及后续的饲养条件。

为了提高存活率，研究人员尝试了不同浓度的冷冻保护剂组合，并发现降低Me2SO的浓度、增加蔗糖的比例可以有效缓解冷冻过程中对幼虫的损伤。例如，使用0.7M Me2SO与0.03M蔗糖混合液，并在30分钟内进行平衡处理，再以2.5°C/min的速度冷却至?35°C，随后在液氮中保存，能够显著提高幼虫的存活时间。实验表明，采用这种优化后的方案，幼虫的存活期可以延长至57天。进一步的实验还发现，降低解冻水浴的温度至18°C，有助于减少幼虫在复苏后的物理损伤，特别是在尾部（pygidium）区域的组织破坏。这一发现对于改善冷冻保存后的幼虫健康状况具有重要意义。

在冷冻保存后的饲养过程中，研究人员采用了改进的饲养方案，以确保幼虫能够获得足够的营养支持。该方案基于近期关于*Platynereis*幼虫定居行为的研究，通过提供更接近其自然饮食的混合饲料，提高了幼虫的生长速度和健康水平。具体而言，幼虫在复苏后每周接受一次绿藻和硅藻的混合饲料，以及一次商业饲料PlanktoMarin的补充。此外，当幼虫开始形成管状结构时，还会提供少量切碎的有机菠菜作为额外的食物来源。这些改进措施显著延长了幼虫的存活时间，并使其能够发育至成年阶段，甚至部分个体成功繁殖。实验还发现，部分复苏后的幼虫在4.5个月后达到性成熟，尽管其成熟速度略慢于未冷冻的对照组。

冷冻保存技术的建立不仅解决了实验室维持大量遗传变异体的难题，还为后续的实验提供了更为稳定和可控的条件。通过冷冻保存，研究人员可以避免因环境波动、污染或实验室操作中断而导致的遗传资源损失。此外，冷冻保存还能够确保不同实验批次之间的遗传一致性，从而提高研究结果的可比性和可重复性。这对于需要长期观察和多代繁殖的研究尤为重要，因为不同批次的幼虫可能因饲养条件、遗传背景或环境因素而表现出不同的发育轨迹和生理状态。

值得注意的是，尽管冷冻保存技术在本研究中取得了显著进展，但其应用仍面临一些挑战。首先，冷冻保存后的幼虫存活率虽然有所提高，但仍然存在较大的个体差异。这可能与供体幼虫的遗传背景、冷冻前的生理状态以及冷冻保存过程中的微小技术差异有关。其次，冷冻保存后的幼虫发育速度较慢，这可能与冷冻处理对某些关键发育过程的潜在影响有关。例如，冷冻可能对幼虫的某些生理机制造成轻微干扰，从而影响其成熟时间。此外，冷冻保存后的幼虫在某些情况下可能需要更长的时间才能达到性成熟，这可能限制了其在某些实验中的应用。

尽管存在这些挑战，本研究的成果仍然具有重要的科学价值。首先，它为*Platynereis dumerilii*的冷冻保存提供了标准化的操作流程，使得不同实验室之间能够共享和复制这一技术。其次，该方案的成功实施表明，通过合理的冷冻保护剂配比、平衡时间和冷却速率的调整，可以显著提高幼虫的存活率和健康水平。这为其他环节动物的冷冻保存研究提供了借鉴。最后，冷冻保存技术的建立不仅有助于提高实验室的资源利用效率，还为未来的基因组研究、药物筛选以及生态学研究提供了更加稳定和可靠的生物材料来源。

综上所述，本研究的冷冻保存方案为*Platynereis dumerilii*的幼虫提供了有效的长期保存方法，使其能够在复苏后正常发育并繁殖。该方案的成功不仅依赖于冷冻保护剂的优化和冷冻过程的控制，还离不开后续饲养条件的改进。尽管存活率仍存在一定的波动，但这一技术的建立为科学研究提供了新的工具和思路。未来的研究可以进一步探索如何提高存活率、减少个体差异以及优化冷冻保存后的发育速度，以更好地满足不同实验需求。同时，冷冻保存技术的推广和应用也将为生物资源库的建设提供强有力的支持，促进更多关于*Platynereis dumerilii*及其相关研究的深入发展。