CRISPR-Cas相关SCCmec变异导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌逃避快速分子诊断检测

《The Journal of Infectious Diseases》：CRISPR-Cas–associated SCCmec variants in methicillin-resistant Staphylococcus aureus evade rapid diagnostic detection

本刊推荐：研究人员针对MRSA快速分子诊断（如Xpert和BCID2）出现假阴性结果的问题，开展了CRISPR-Cas相关SCCmec变异体的系统研究。通过对临床分离株进行基因组测序和体外诊断验证，发现2%的MRSA携带此类变异体，其中11个SCCmec/连接区变异可逃避BCID2或Xpert检测，且集中于医院相关CC5克隆。该研究揭示了新型诊断逃逸机制，强调需通过基因组监测和体外引物筛选前瞻性防控变异株传播。

　　

在全球范围内，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）仍是医疗相关感染的主要病原体之一。尽管2005年至2012年间血流感染率下降约13%，但此后进展陷入停滞。即使采用最佳治疗方案，MRSA感染的死亡率仍居高不下，使其成为全球抗菌药物耐药性相关死亡的主要驱动因素。在这一严峻背景下，快速、准确的病原学诊断对改善患者预后至关重要。

目前临床广泛应用的快速PCR检测方法，如Xpert MRSA/SA Blood Culture（Cepheid）和Blood Culture Identification 2（BCID2, BioFire），通过早期识别MRSA指导及时治疗，显著改善了患者结局。这些检测不仅靶向mecA基因和金黄色葡萄球菌特异标记（如spa），还依赖SCCmec（Xpert）或SCCmec-orfX连接区（BCID2）的保守序列，将mecA基因确认为来源于金黄色葡萄球菌。然而，该连接区的序列变异可能破坏引物结合，导致假阴性结果，进而影响临床决策。因此，了解此类MRSA变异体的流行情况及分子基础对评估检测性能具有重要意义。

成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）及其相关Cas蛋白是细菌抵御噬菌体入侵的重要系统。在MRSA中，CRISPR-Cas系统位于SCCmec元件内，可能通过水平基因转移来自凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-negative staphylococci, CoNS）——这类系统在CoNS中携带率较高（约35%），但在金黄色葡萄球菌中较为罕见（约2%）。然而，CRISPR-Cas系统对MRSA分子检测的影响此前尚未明确。

本研究由纽约大学格罗斯曼医学院等机构合作完成，报道了一例MRSA菌血症病例，其耐药性因CRISPR-Cas相关SCCmec变异体而未被快速检测发现。后续生物样本库筛查揭示了更多变异体，包括在医院环境中传播的菌株。尽管目前这类变异体尚属少见，但它们对诊断准确性构成威胁，凸显了需要开展基因组监测，将检测重点从对诊断失败的反应性调查转向对新兴诊断逃逸变异体的前瞻性监控。

为开展本研究，研究人员收集了来自NYU Langone Health（NYULH）长岛院区的一例MRSA菌血症病例分离株，并利用机构生物样本库中9440株经基因组测序的金黄色葡萄球菌分离株（包括5997株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌[MSSA]和3443株MRSA）进行筛查。所有菌株均通过Illumina测序（覆盖度120-520×），并对部分菌株进行Nanopore长读长测序和杂交组装，获得完整染色体。通过BCID2和Xpert试剂盒评估菌株的诊断可检测性，并采用系统发育分析和时空重叠标准评估传播事件。

病例发现与基因组分析

研究始于一名88岁男性患者的院内菌血症病例，其血培养提示革兰阳性球菌成簇生长，BCID2检测报告金黄色葡萄球菌为“检出”，但用于评估SCCmec-orfX连接区的“mecA/C and MREJ”靶标为“未检出”。基于这一结果，经验性万古霉素治疗被降级为苯唑西林约48小时，后续药敏试验确认MRSA后调整为达托霉素联合头孢洛林治疗六周，患者最终康复。对该病例分离株（139_092）的基因组测序显示，其为克隆复合体5（Clonal Complex 5, CC5）医院相关MRSA，携带mecA基因但缺乏典型的SCCmec II型或IV型盒，取而代之的是一个编码I类IIIA型CRISPR-Cas系统的变异SCCmec元件。进一步分析发现，该元件的orfX-SCCmec连接区存在变异，可能阻碍了检测引物的结合。

CRISPR-Cas SCCmec元件的流行特征

在生物样本库筛查中，研究人员从45名患者中鉴定出64个携带CRISPR-Cas系统的变异体（占筛查菌株的2%），包括59株MRSA和5株MSSA。在41株独特MRSA菌株中，发现39个SCCmec相关CRISPR-Cas I类IIIA型系统和1个II类系统——后者为首次在金黄色葡萄球菌中报道。根据克隆复合体、SCCmec型别、CRISPR-Cas亚型和抗噬菌体防御基因组合（DefenseCombinationID）等特征，菌株被划分为6个变异亚克隆（防御组A–F）。值得注意的是，部分MSSA菌株保留推测为残留的SCCmec基因（如cstB/R），结合序列同源性及系统发育背景，提示其可能由MRSA通过SCCmec切除丢失mecA基因而来，而CRISPR-Cas相关元件的携带可能加剧mecA的不稳定性。

对诊断检测性能的影响

对6个mecA阳性CRISPR-Cas亚克隆的代表菌株进行检测评估发现，诊断逃逸现象集中于CC5克隆：两个CC5亚克隆的SCCmec或连接区分别无法被Xpert和BCID2检测。根据相关克隆的重复实验结果，预计40个SCCmec/连接区中有11个会被至少一种平台漏检。值得注意的是，Xpert检测即使未识别SCCmec，仍可能基于mecA和spa的循环阈值（Ct_t）报告“MRSA阳性/SA阳性”，表明其基于规则的算法在控制条件下对某些CRISPR-Cas相关变异体的检测更具鲁棒性，但这一优势仍需临床血培养环境的头对头验证。

医疗环境传播与地理分布

携带CRISPR-Cas SCCmec的金黄色葡萄球菌主要分布于布鲁克林区患者（29/45），且多数患者有既往住院或医疗接触史，尤其是长期护理机构。通过时空重叠标准和基因组分析，研究识别出一个包含12名患者的传播簇（直接传播），其中11人居住在布鲁克林，9起传播发生在NYULH布鲁克林院区。此外，利用宽松标准（允许在指示病例离开病区后获得感染）还识别出更多CC45传播事件和一个涉及不可检测菌株的CC5传播簇，近 identical分离株的回收支持了院内传播的存在。

公共基因组筛查

对GenBank中70,597个mecA阳性MRSA组装体的筛查显示，1.4%（n=1000）携带CRISPR-Cas系统（几乎均为I类IIIA型），其中47个组装体满足严格的mecA相关CRISPR-Cas共定位标准，代表与NYULH变异体高度保守的类似株。这些分离株覆盖多种序列型别（包括CC5和CC45）和地理区域，提示独立获得事件。体外引物结合分析预测其中24个（51%）可能逃避检测，表明具有诊断逃逸潜能的SCCmec相关CRISPR系统分布广泛。

本研究揭示了MRSA进化导致其逃避常用快速分子诊断的新机制。CRISPR-Cas相关SCCmec元件的出现，通过破坏当前检测的关键靶标，使部分菌株无法被识别——这一机制不同于新型mec同源基因或小规模SCCmec/orfX连接区多态性。系统发育分析表明，这类变异体多次独立出现，目前集中于CC45和CC5克隆，并在医疗环境中持续传播。尤其值得关注的是，诊断逃逸集中于最主要的医院相关谱系CC5，提示最具临床意义的克隆可能正变得难以检测。若此类变异体在筛查和控制措施（如仅针对可检测菌株的去定植）的选择压力下进一步扩散，可能危及指导早期治疗的快速MRSA诊断的可靠性。

研究结果强调了病原体进化对诊断准确性构成的持续威胁。逃逸变异体的临床后果取决于当地流行程度及快速检测结果对抗菌药物选择的影响。在血流感染中，假阴性结果可能延误有效治疗，而在定植监测中漏检则可能影响感染控制。因此，对当地逃逸变异体频率的评估至关重要，既可优化现有检测方法，也能为替代性检测平台的设计提供依据。在存在此类变异体传播的医疗环境中，临床医生应谨慎解读侵袭性感染中MRSA快速检测的阴性结果。

综上所述，本研究强调需要通过基因组监测和体外引物筛选，在诊断逃逸变异体广泛传播前实现早期识别。持续监控新发变异体，并与诊断制造商合作更新分子靶标，是维持MRSA早期检测效力的关键。