针对与松树褐斑针叶枯病相关的真菌分离株进行DNA培养和提取的优化方案

《PLOS One》：Optimized protocol for culturing and extracting DNA from fungal isolates associated with brown spot needle blight in pine trees

有效培养与DNA提取方法对褐斑针叶枯病真菌研究至关重要。通过比较4种培养基（SD、PD、ME、YEPD）的固体和液体培养效果，发现SD在菌落直径（3.90mm）和生长速率（3.34mm/周）上最优。DNA提取方面，3% CTAB+PVP法产量最高（47.3ng/μL），纯度最佳（1.88），显著优于其他方法。研究提出SD培养结合CTAB-PVP提取法，为真菌基因组学和分子研究提供标准化流程，有效解决森林病害研究中的样本质量瓶颈。

　　在森林生态系统中，真菌病害对树木健康和经济价值构成严重威胁，其中棕色斑针腐病（Brown Spot Needle Blight, BSNB）是一种影响多种松树（*Pinus*）物种的重要病害。该病害由主要病原体* Lecanosticta acicola*（原名为*Mycosphaerella dearnessii*）引起，但也可能涉及其他内生真菌，如*Sydowia polyspora*和*Diplodia sapinea*。BSNB的感染过程通常会导致松针出现黄色和棕色的斑块，并最终引发针叶脱落，严重时甚至导致树木死亡。这种病害不仅影响松树的生长，还对林业产业造成重大经济损失，尤其是在美国东南部地区，该地区拥有大规模的松树种植，对林业经济至关重要。

为了有效研究BSNB病原体并推动相关防治措施的开发，科学家们需要高效的培养和DNA提取方法。这些方法能够支持大规模的高质量DNA获取，进而用于基因组学、分子生物学以及病原体演化分析。本研究旨在通过系统评估四种常用的真菌培养基（Sabouraud葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、酵母提取物肽葡萄糖琼脂和3%麦芽提取物）在固态和液态培养中的表现，同时比较四种DNA提取方法，包括基于CTAB（十二烷基三甲基溴化铵）化学的改良方案和商业化的Qiagen DNeasy试剂盒。通过这些比较，本研究希望找到一种既支持真菌快速生长又能够高效提取DNA的培养和提取组合，从而为后续的分子分析提供可靠的基础。

在真菌培养方面，研究发现Sabouraud葡萄糖培养基在固态和液态条件下均表现出最佳的生长性能。具体而言，在固态培养中，Sabouraud葡萄糖琼脂支持的菌落直径最大，平均达到3.90毫米，而其他三种培养基（麦芽提取物、马铃薯葡萄糖和酵母提取物肽葡萄糖）的菌落直径则相对较小。在液态培养中，Sabouraud葡萄糖培养基同样表现出显著优势，其总生物量最高，达到74.2克，而马铃薯葡萄糖培养基则表现最差，总生物量仅为15.8克。这种生长性能的差异可能与培养基的营养成分和pH值有关。Sabouraud葡萄糖培养基含有较高的葡萄糖浓度和适度的肽类成分，同时其酸性环境（约pH 5.6）有助于真菌代谢，同时抑制细菌生长。相比之下，马铃薯葡萄糖培养基由于其较低的酸性环境和缺乏肽类成分，可能未能满足某些真菌的营养需求，从而限制了其生长速度和生物量积累。

在DNA提取方面，研究采用了多种方法，包括基于CTAB的改良方案和商业试剂盒。结果显示，3% CTAB + PVP（聚乙烯吡咯烷酮）方案在DNA浓度和纯度方面均表现出色，其平均DNA浓度达到47.3 ± 5.80 ng/μL，远高于其他方案。此外，该方案的260/280吸光度比值接近理想的1.8，表明其DNA纯度较高，几乎不含杂质。相比之下，Qiagen试剂盒虽然在纯度方面表现良好，但其DNA浓度较低，平均为16.2 ± 2.86 ng/μL。这一结果可能与试剂盒的硅柱分离机制有关，该机制在高输入量的情况下可能对DNA的回收效率产生限制。

值得注意的是，3% CTAB + SDS（十二烷基硫酸钠）方案虽然在某些情况下能够产生较高的DNA浓度，但其260/280比值显著偏高，这可能意味着该方案在提取过程中混入了RNA或其他紫外吸收物质，从而影响DNA的纯度。此外，2% CTAB + SDS方案的260/280比值甚至更高，进一步表明该方案可能不适用于需要高纯度DNA的分子研究。因此，尽管某些CTAB方案在提取效率方面表现良好，但其在DNA纯度上的不足限制了其在下游应用中的适用性。

为了进一步验证这些方法的有效性，研究团队对提取的DNA进行了PCR扩增和Sanger测序，分析了真菌的ITS（内部转录间隔）区域。结果表明，所有样本均属于Dothideomycetes类群，且序列长度和质量均符合预期，表明所提取的DNA适合用于BLASTn数据库查询，以确定病原体的种类。这一过程不仅验证了培养和提取方法的可靠性，也为后续的分子生物学研究提供了高质量的DNA材料。

本研究的结果具有重要的实际意义。首先，Sabouraud葡萄糖培养基因其在促进真菌生长方面的卓越表现，被推荐为BSNB病原体的首选培养基。它不仅能够提供足够的菌丝体生物量，还能够在液态培养中支持更高的DNA产量，这为后续的基因组学研究提供了便利。其次，3% CTAB + PVP方案在DNA提取方面表现最佳，能够在保证高产量的同时保持较高的纯度，使其成为一种理想的提取方法。相比之下，商业试剂盒虽然在某些方面提供了标准化和便利性，但其DNA产量相对较低，可能无法满足需要大量DNA的实验需求。

然而，本研究也指出了其局限性。首先，所使用的培养基和提取方法仅针对BSNB病原体及其在松针上的生长特性进行了优化，因此其适用性可能受到其他真菌种类或不同宿主植物的限制。此外，虽然260/280比值被用来评估DNA纯度，但这种方法可能存在一定的局限性，无法完全排除RNA或其他杂质的干扰。因此，未来的研究可以考虑结合其他评估方法，如电泳分析或高通量测序，以更全面地评估DNA的纯度和完整性。

综上所述，本研究通过系统比较不同的培养基和DNA提取方法，为BSNB病原体的研究提供了一种可靠且高效的实验流程。Sabouraud葡萄糖培养基与3% CTAB + PVP提取方法的组合被证明是当前研究中最优的选择，能够在促进真菌生长的同时获得高质量的DNA。这一发现不仅有助于推动BSNB病害的分子机制研究，也为其他森林真菌病害的分子分析提供了可借鉴的模板。通过优化这些关键步骤，科学家们可以更有效地揭示真菌的遗传多样性、演化潜力以及其在生态系统中的作用，从而为制定更加精准和可持续的防治策略提供科学依据。