鉴定一种在扁形动物生殖转换过程中终止无性状态所必需的innexin蛋白

《PLOS Genetics》：Identification of an innexin required for termination of the asexual state in planarian reproductive switching

生殖切换调控机制：通过RNA测序和干扰实验鉴定斑马涡虫生殖切换的四个关键基因，包括新发现的间隙连接蛋白Dr-siri及其调控网络。

　　在自然界中，许多动物能够根据环境变化、生命周期阶段或两者结合，实现从无性繁殖到有性繁殖的转变。这种繁殖策略使它们能够同时受益于两种繁殖方式的特征。无性繁殖通常分为**孤雌生殖**和**营养繁殖**两种类型。在孤雌生殖中，个体发展出卵巢并产卵，而从孤雌生殖向有性生殖转变的关键事件是**睾丸的形成**。相比之下，营养繁殖不需要个体本身具备生殖细胞，因此它们必须在胚胎后发育并维持由多能干细胞衍生的生殖细胞，当从营养繁殖转向有性繁殖时。然而，控制这种胚胎后生殖发育的复杂机制仍然不明确。

以**裂唇虫（Dugesia ryukyuensis）**为例，它们可以通过刺激具有生物活性的化合物——**性诱导物质**，实现从营养繁殖向有性繁殖的转变。这些性诱导物质在扁形动物门（Platyhelminthes）中广泛存在，包括寄生的扁虫。有性繁殖与无性繁殖的两种模式由成年多能干细胞所调控，这些干细胞可以在无性状态下生成任何类型的体细胞组织，而在有性状态下则会生成并维持两性生殖器官。本研究通过RNA测序分析，探讨了裂唇虫在性诱导过程中的关键基因，并发现**四个关键基因**对于有性繁殖至关重要。这些基因中的一个——**Dr-siri**（裂唇虫性诱导相关联的innexin）——可能在构建睾丸干细胞微环境的过程中发挥了重要作用，从而推动了胚胎后生殖发育的“休眠突破”。研究还指出，睾丸的形成可能是从营养繁殖向有性繁殖转变的关键。

在研究中，我们首先通过RNA测序，聚焦于“无回头点”这一性诱导过程中的关键阶段。在这一阶段，即使停止性诱导物质的刺激，裂唇虫也会继续发育生殖器官，表明该阶段是性诱导的临界点。在实验中，通过将裂唇虫喂食含有性诱导物质的饲料，我们观察到它们在大约一个月内依次形成生殖器官。我们还通过“再生测试”来判断裂唇虫是否已超越“无回头点”，即在切开后，如果再生出的个体仍能形成生殖器官，则说明已无法逆转其无性状态。

通过分析这些基因在不同性诱导阶段的表达情况，我们识别出**三个转录因子基因**和一个**间隙连接蛋白基因**（Dr-siri）。这些基因的表达在裂唇虫从无性状态向有性状态转变的过程中表现出显著变化，特别是睾丸的形成过程。我们通过定量PCR和原位杂交实验验证了这些基因的表达模式，并发现它们在有性状态下的表达显著高于无性状态。其中，Dr-siri基因在睾丸的形成过程中具有特殊的重要性，其表达的缺失会导致睾丸发育受阻，从而影响性诱导的完成。

研究还表明，这些基因在不同阶段的表达模式呈现出明显的动态变化。例如，在性诱导初期，某些基因的表达会迅速上升，而到了后期，这些基因的表达模式会逐渐调整。通过敲除这些关键基因，我们观察到裂唇虫无法完成性诱导过程，这进一步支持了它们在生殖模式转变中的重要性。特别是Dr-siri基因，其表达的缺失导致睾丸无法形成，而其他生殖器官如卵巢和卵黄腺仍然能够发育，但未能进入完全有性状态。这表明，睾丸的形成是性诱导过程中不可或缺的环节。

在裂唇虫的性诱导过程中，我们还观察到一种**多能干细胞微环境的建立**。这种微环境可能通过Dr-siri蛋白形成间隙连接，从而促进生殖细胞的分化和发育。这与某些动物中通过间隙连接进行细胞间通信的机制相似，例如在果蝇（Drosophila melanogaster）和线虫（Caenorhabditis elegans）中，间隙连接蛋白（innexins）在维持生殖细胞发育中发挥重要作用。我们的研究进一步表明，裂唇虫中的Dr-siri蛋白可能在生殖细胞分化过程中充当信号传递的桥梁，使得性诱导物质能够被有效地运输到睾丸发育的部位，从而推动有性生殖的启动。

在进一步的实验中，我们通过饥饿实验验证了这些基因在维持有性状态中的作用。即使在饥饿条件下，裂唇虫仍然保留其有性状态，但其生殖器官（尤其是睾丸）可能表现出一定程度的退化。这提示我们，性诱导过程不仅涉及生殖器官的形成，还可能包括**维持有性状态的机制**。例如，Dr-siri蛋白的表达在饥饿条件下会减弱，而其他关键基因如Dr-nhr-1、Dr-dmd-1和Dr-klf4l则可能在维持性状态方面发挥不同的作用。这种动态的基因表达模式为理解裂唇虫的生殖模式转变提供了新的视角。

此外，研究还指出，裂唇虫的性诱导过程可能与某些寄生扁虫的性诱导机制存在相似性。这些寄生虫同样能够通过某种性诱导物质实现从无性繁殖到有性繁殖的转变，而这些物质的分子特性与裂唇虫中的性诱导物质高度相似。因此，我们推测，**Dr-siri蛋白及其相关的间隙连接机制**可能在更广泛的动物中存在，尤其是在那些具有性诱导能力的物种中。这一发现为研究其他动物的生殖模式转变提供了潜在的分子基础。

研究中还涉及了多种实验技术，包括**RNA测序（RNA-seq）**、**定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）**和**原位杂交（WISH）**，以确保对基因表达的准确分析。通过这些技术，我们能够识别出关键基因的表达模式，并验证它们在性诱导过程中的功能。此外，**荧光原位杂交（FISH）**被用于进一步分析这些基因在组织中的定位，以确认它们是否在特定细胞类型中表达，例如生殖细胞或支持性细胞。

总之，本研究揭示了裂唇虫在从营养繁殖向有性繁殖转变过程中涉及的**四个关键基因**，其中**Dr-siri**是与睾丸分化直接相关的间隙连接蛋白。这些基因的表达模式和功能分析表明，性诱导过程中，睾丸的形成是决定是否能够从无性状态转向有性状态的关键因素。同时，研究还指出，性诱导物质可能通过间隙连接的传递作用，影响多能干细胞的分化和生殖器官的发育。这些发现不仅有助于理解裂唇虫的生殖模式，也为研究更广泛的动物生殖调控机制提供了新的思路。