一种经过益生菌生物膜修饰的骨替代材料的双重功能特性：既能抵抗感染，又能促进骨免疫调节

《Bioactive Materials》：Dual functional properties of a probiotic biofilm-decorated bone substitute to combat infection and promote osteoimmunomodulation

羟基磷灰石支架表面修饰阿克曼氏菌生物膜（Akk-HA）可协同抑制病原菌定植并调控巨噬细胞免疫微环境，通过激活PI3K/AKT通路促进IL-10分泌，从而抑制炎症反应并增强成骨分化，在小鼠感染性骨缺损模型中显著改善骨再生效果。

　　在口腔及颌面部医学领域，骨缺损的治疗一直是一个具有挑战性的课题。这类缺损常常由感染引发，如牙周炎、种植体周围炎、根尖周病以及颌骨骨髓炎等，它们不仅影响患者的咀嚼功能和面部结构完整性，还可能导致严重的炎症反应和组织破坏。传统的治疗方法主要依赖于自体骨移植、异体骨移植、异种骨移植以及合成材料如羟基磷灰石（HA）和钙磷水泥等。然而，这些材料在临床应用中面临两大核心问题：一是容易成为病原菌的附着场所，从而增加感染风险；二是缺乏内在的免疫调节能力，无法有效引导免疫微环境向有利于骨再生的方向转变。为了克服这些限制，研究人员探索了通过引入益生菌来改良骨移植材料的策略，其中，阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，简称Akk）作为一种具有显著免疫调节能力的肠道益生菌，受到了广泛关注。

Akkermansia muciniphila是一种在肠道黏膜层中定植的益生菌，通常占肠道菌群总量的4%。该菌能够降解黏液层，释放短链脂肪酸（SCFAs），维持肠道上皮细胞的稳态，并为共生菌提供代谢底物。此外，Akk还能够通过竞争性生长抑制致病菌的增殖，同时直接调控多种免疫细胞，包括树突状细胞、T细胞和巨噬细胞等。在炎症条件下，Akk能够促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型极化，从而减轻炎症反应。在实验性牙周炎模型中，通过灌胃方式给予活体Akk已被证明可以显著减轻牙周炎症和组织破坏，表明其在口腔和颌面部骨缺损治疗中具有潜在的临床价值。

尽管活体益生菌通常被认为是安全的，但其在临床应用中仍存在一定的风险，例如通过组织入侵引发全身感染、产生抗生素耐药性以及破坏肠道微生物群的平衡。因此，研究者开始关注非活性益生菌和微生物提取物等替代形式，因为它们具有更高的稳定性和安全性。经巴氏杀菌的Akk能够保留其结构完整性和生物活性，包括调节脂质代谢、维持免疫系统稳态以及调控肠道菌群组成，从而提升宿主的整体健康水平。基于这些特性，研究者提出了一种新的假设：通过将巴氏杀菌的Akk与临床常用的骨移植材料（如HA）结合，可以开发出一种具有双重功能的生物材料，既能有效抵抗病原菌的附着，又能通过调控巨噬细胞功能建立有利于骨再生的免疫微环境，从而促进口腔及颌面部骨缺损的修复。

在本研究中，研究团队成功制备了一种以Akk为涂层的HA支架材料，即Akk-HA。该材料的制备过程包括将HA微球与Akk在厌氧条件下共培养3天，以促进Akk在HA表面形成生物膜。随后，未附着的Akk通过离心和洗涤去除，最终获得稳定的Akk-HA材料。通过扫描电子显微镜（SEM）和定量聚合酶链式反应（qPCR）等手段，研究团队对Akk-HA的制备和特性进行了系统分析。结果表明，Akk成功地附着在HA表面，并且其在HA上的附着量达到了每毫克HA约4.1×10?个菌落形成单位（CFU）。此外，通过能量色散X射线光谱（EDS）分析发现，Akk-HA的碳含量显著高于未涂层的HA，进一步证实了Akk在HA表面的稳定定植。材料的机械性能、表面润湿性、稳定性及降解性也得到了评估，结果显示Akk-HA具有良好的机械性能和表面亲水性，且在动态清洗条件下仍能保持其结构的完整性。

为了进一步验证Akk-HA的抗粘附能力，研究团队选择了三种常见的致病菌——牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）、核梭杆菌（F. nucleatum）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）进行实验。结果显示，与未涂层的HA相比，Akk-HA显著降低了这些病原菌的附着量，其中P. gingivalis的附着量减少了89.34%，F. nucleatum的附着量减少了75.18%。这一发现表明，Akk-HA能够通过其表面特性有效阻止病原菌的定植，从而降低感染风险。同时，研究团队还发现，Akk-HA能够通过调控巨噬细胞的免疫表型，减少促炎因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的分泌，同时促进抗炎因子（如IL-10）的释放，进一步支持其在免疫调节方面的潜力。

巨噬细胞在骨再生过程中扮演着至关重要的角色，它们不仅能够清除病原体，还能通过分泌多种细胞因子影响骨形成和骨吸收的平衡。研究团队通过细胞免疫荧光和ELISA实验发现，Akk-HA能够显著提高巨噬细胞中CD206的表达（代表M2表型），同时降低CD86的表达（代表M1表型），表明其能够引导巨噬细胞向具有促骨再生功能的M2表型极化。此外，Akk-HA还能促进巨噬细胞分泌IL-10和OSM等促再生因子，这些因子在骨再生过程中具有重要作用。例如，IL-10能够通过调节炎症反应和促进细胞外基质的形成，间接支持骨再生；而OSM则通过激活gp130信号通路，直接促进成骨细胞的分化。

为了进一步探究Akk-HA的促骨再生机制，研究团队还进行了Western blot分析，发现Akk-HA能够显著激活PI3K/AKT信号通路，从而促进IL-10的表达。这一信号通路在细胞生物学中具有重要作用，尤其是在成骨细胞的分化过程中。通过使用PI3K/AKT通路抑制剂（PI3K-IN-1）进行实验，研究团队发现该通路的阻断会导致IL-10表达水平的显著下降，并进一步抑制PDLCs的成骨能力。这表明，Akk-HA通过激活PI3K/AKT通路促进IL-10的产生，从而为PDLCs的成骨分化提供支持。

在动物实验中，研究团队构建了感染性牙周骨缺损模型，以评估Akk-HA的体内疗效。实验结果显示，Akk-HA在术后1周内显著降低了感染部位的细菌载量，同时在术后4周时表现出更优的骨再生效果。微CT分析显示，Akk-HA组的牙槽骨高度和密度均显著高于对照组，且其骨体积分数（BV/TV）、骨矿密度（BMD）和骨小梁数量（Tb.N）也明显改善。组织学分析进一步支持了这些发现，H&E染色显示Akk-HA组的炎症细胞浸润显著减少，且新骨形成更加明显；Masson染色则揭示了Akk-HA组中胶原纤维的有序沉积，表明修复后的骨组织更加成熟。此外，免疫荧光和免疫组化分析显示，Akk-HA能够显著上调IL-10的表达，同时下调IL-6和RANKL的表达，而上调OPG的表达，这表明Akk-HA通过调节骨代谢相关因子，有效促进了骨再生并抑制了骨吸收。

尽管Akk-HA在实验中表现出良好的抗感染和促骨再生效果，但研究团队也指出了其在临床转化过程中可能面临的挑战。例如，在机制层面，目前尚不清楚Akk-HA与巨噬细胞之间的具体相互作用及其抗菌效应的分子基础。未来的研究需要进一步结合生物活性成分的分离和LC-MS/MS分析，以明确Akk-HA中的关键活性成分及其作用机制。此外，Akk在HA表面的修饰密度目前主要通过调整培养时间来控制，但为了实现更精确的调控，可能需要引入更先进的技术，如微流控技术和纳米级涂层工艺。最后，研究团队强调，动态监测Akk在体内的代谢活动及其分布和清除路径对于评估其潜在的毒副作用至关重要。

综上所述，本研究成功开发了一种新型的Akk-HA生物材料，它不仅能够有效抵抗病原菌的附着，还能通过调控巨噬细胞功能，促进骨再生。这一成果为口腔及颌面部感染性骨缺损的治疗提供了一种兼具抗菌和免疫调节功能的创新策略，具有重要的临床应用前景。然而，为了实现该材料的广泛应用，仍需进一步研究其在体内的长期稳定性和安全性，并探索更精确的表面修饰方法。