由诱导曲率的蛋白质实现的膜片管化过程

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Tubulation of membrane sheets by curvature-inducing proteins

研究利用介观模型揭示内质网（ER）管状结构形成机制，发现蛋白质浓度、内在曲率与膜刚度非线性耦合调控ER形态转换。

　　在本研究中，我们通过一种介观尺度的膜-蛋白相互作用模型，探索了内在曲率、蛋白浓度以及膜刚性如何共同调节内质网（ER）的管状结构形成。内质网是高度动态的细胞器，它在管状和片状结构之间不断重塑，这种重塑过程由曲率诱导蛋白和膜力学共同驱动。理解ER形状变化背后的物理机制对于揭示其在细胞稳态和疾病中的作用至关重要。我们的研究结果表明，管状结构的临界蛋白浓度取决于内在曲率，且这种依赖关系是非线性的，这是由于吸附能力与重塑能力之间的竞争。此外，当蛋白吸附导致膜刚性增加时，这种刚性在较低的内在曲率下会增强管状结构的形成效率，并在较高的内在曲率下改变管状结构的几何形状。通过构建相图，我们确定了膜重塑所需的关键蛋白浓度阈值，揭示了不同曲率诱导蛋白如何协调ER形态发生。这些发现为ER形状调控提供了定量框架，有助于理解ER在生理和病理条件下的动态变化。

内质网在多种细胞过程中发挥着关键作用，包括蛋白质合成、脂质代谢、钙离子储存和细胞器之间的通讯。其高度的表面积与体积比有助于细胞内的物质分布，而片状结构则在高分泌需求的细胞中更为显著。ER的管状和片状形态之间的平衡受到曲率诱导蛋白、胞质骨架相互作用和脂质组成的影响，使得ER能够动态重塑形状以适应细胞的需求。曲率诱导蛋白如Reticulons（RTNs）和DP1/Yop1（REEPs）维持管状结构，而Clmp-63、P180和Kinectin则与粗面内质网相关，维持片状结构。在细胞分裂过程中，ER会从片状结构转变为分支的管状网络，而在未折叠蛋白应激的情况下，ER则会从管状结构转变为堆叠的片状结构。这些变化体现了ER在细胞环境中的灵活性和适应性。

RTNs具有短的发夹状疏水结构，这些结构插入ER的脂质双分子层中，导致局部弯曲。与传统的跨膜蛋白不同，RTNs并未完全穿过膜，而是不对称插入，驱动曲率形成。RTNs具有寡聚化能力，这种能力增强了其曲率诱导效果，通过蛋白质间的合作相互作用来强化膜的弯曲。实验研究表明，RTNs的过表达会增加ER的管状结构，而其缺失则会导致管状结构碎片化和片状结构的扩张。此外，除了RTNs，还有其他蛋白家族参与ER膜曲率的调控，如REEPs，它们通过短的跨膜发夹结构嵌入膜中并促进膜弯曲。REEPs通常与RTNs协同作用，形成稳定的曲率复合物，从而维持ER管状结构。RTNs和REEPs的共同缺失会导致ER管状结构的完全消失，强调了它们在维持ER形态中的关键作用。此外，基于微管的运动蛋白如kinesin-1和dynein通过拉拽管状结构沿着微管轨道重塑ER形态，这些主动力有助于ER网络的动态重塑和连续性，确保管状结构在细胞质中有效延伸和重新分布。

理解ER再组织的机制对于了解细胞功能、疾病过程和治疗进展至关重要。特别是，ER管状结构的缺陷已被与神经退行性疾病、代谢障碍和应激相关的ER功能障碍联系在一起。研究ER形态调控的分子基础可以为涉及ER稳态破坏的疾病提供潜在的治疗靶点。然而，关于活细胞中膜组织的物理机制仍然存在不确定性。尽管实验研究已经揭示了ER动态的许多方面，如曲率诱导蛋白的定位和细胞骨架相互作用对ER形状的影响，但它们往往无法明确区分生物物理和生化因素的单独贡献。这种不确定性主要是由于实验中难以隔离和分析多种因素对ER形状的贡献。相比之下，计算模型允许在受控条件下进行研究，可以独立变化各个参数，从而提供更清晰的机制洞察。计算模拟还能够直接可视化复杂系统动力学，并提供广泛的热力学和高分辨率结构数据，揭示分布和时间依赖的性质，这些性质在实验中较难获得。因此，模拟为研究ER片状到管状结构的转变提供了互补的方法，允许对实验中难以调节但对ER响应细胞应激、机械力或蛋白表达时的再组织至关重要的变量进行精确控制。

由于细胞膜的复杂性和多尺度特性，建模细胞膜行为极具挑战性。这种复杂性促使我们采用拉格朗日粒子模型。拉格朗日粒子模型适用于研究纳米尺度的蛋白质-膜相互作用，但无法达到ER结构的微米尺度。因此，需要采用连续模型，以捕捉蛋白质在膜中的介观相互作用。介观膜-蛋白（MesM-P）模型代表了分子模型和连续模型之间的中间方法，提供了一种粗粒化框架，用于模拟大尺度膜动力学。该模型将膜视为一个连续体，其局部曲率约束取决于蛋白质浓度场，从而实现了蛋白质-膜相互作用、曲率传播和管状结构形成的高效建模。

本研究旨在利用MesM-P模拟来探讨调控ER管状结构的生物物理机制。我们重点量化了蛋白质内在曲率、吸附和膜刚性对膜片到管状网络的转变的影响。具体而言，我们确定了管状结构形成的临界阈值，分析了蛋白质诱导的刚性对曲率传播和蛋白质吸附的影响，并构建了相图，以展示这些参数之间的关系。这些模拟提供了新的视角，揭示了曲率诱导蛋白如何在生理和病理条件下调控ER结构。

在本研究中，我们使用MesM-P模型模拟蛋白质负载膜在溶剂环境中的动态行为。MesM-P模型是一种无网格的粒子方法，其中每个膜准粒子代表一个局部脂质双分子层场以及相应的局部蛋白质组成场。同样，溶剂准粒子代表周围的介质，包括溶液中的蛋白质密度。MesM-P模型基于相场理论，通过邻近溶剂和膜准粒子之间的蛋白质组成交换来演进。这种动态耦合将局部蛋白质密度与膜曲率联系起来，使膜结合蛋白的插入和自组织成为可能，从而驱动实验相关尺度下的形态变化。

蛋白质组成场通过系统哈密顿量中的多个项与膜耦合，这些项根据局部蛋白质密度调整所有与曲率和力学相关的能量贡献。力矩和力由哈密顿量导出，而蛋白质组成的变化则由朗道-吉布斯（LG）动力学控制。这种耦合受到表面变形的影响，推动系统向自由能最小值发展，从而最终塑造膜结构。下面我们将回顾该方法的关键细节，而完整的MesM-P方法描述可参考Davytan等人。

系统哈密顿量包含了多个贡献项，这些项及其对应的参数在表1中总结。对于总共有N个准粒子的系统，其中M个是膜准粒子，H表示总哈密顿量，由H_LJ216（Lennard-Jones势）、H_Bend（弯曲势）、H_Lucy（Lucy势）、H_IC（内在曲率势）、H_Olig（寡聚化势）和H_?（蛋白质密度势）组成。膜的正常向量定义了曲率计算的局部膜取向，而膜平面向量则代表了蛋白质对自发曲率的排列。蛋白质密度?表示每个准粒子的蛋白质密度，范围从-1（最大蛋白质浓度）到1（蛋白质自由状态）。

膜的体积膨胀/收缩行为由Lennard-Jones型势能表示，该势能作用于相邻膜粒子之间。该势能通过作用在膜粒子之间的力和相互作用来实现。其中，排斥项（r^-16）强制局部不可压缩性，而吸引项（r^-2）允许形成孔洞和空隙，这对于形态重塑是必要的。弯曲能基于Helfrich的连续弹性表示，同时考虑蛋白质浓度场的影响。蛋白质浓度场可以离散化为一个包含N个准粒子的系统，如公式（3）所示。此外，还引入了由蛋白质浓度场驱动的弯曲势能变化，这种变化会影响膜的曲率传播和蛋白质吸附。

在本研究中，我们还分析了膜的形态变化，包括管状结构的长度和半径。通过从点云数据中提取中心线和半径，我们能够量化分析管状网络的几何特性。中心线和局部半径由MATLAB通过主成分分析（PCA）和样条插值计算得出。在初始阶段，PCA通过奇异值分解（SVD）确定点云数据的主轴方向，第一个主成分被视为管状结构的纵向轴。每个数据点随后被投影到该轴上，以获得沿管状结构长度的位置。这些位置用于将结构划分为n个区间，每个区间代表管状结构的横截面。每个区间内的点集用于计算局部质心，这些质心近似表示该横截面的中心。质心通过分段三次埃尔米特插值（pchip）连接和插值，以构建中心线，从而捕捉曲率。通过测量每个点在点云中到中心线的最小欧几里得距离，我们可以计算局部半径，从而获得平均半径和标准差，并估计全局直径。分析在点云中约60%的管状结构上进行，这些结构是从点云中随机选择的。

为了进一步研究蛋白质的刚性对膜重塑的影响，我们分析了初始平坦膜在接触不同蛋白质弯曲刚性系数（k0）时的行为。蛋白质的刚性可以通过多种机制改变膜的弯曲刚性和刚度。首先，具有BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域的蛋白质，如amphiphysin和endophilin，形成半圆形支架，紧密地将膜塑造成特定的曲率，从而减少其自由变形的能力。其次，不对称插入脂质双分子层的跨膜蛋白，如RTNs，通过嵌入楔形结构域来产生局部曲率，从而增加膜的弯曲模量。最后，高密度的蛋白质聚集体会限制脂质的横向流动性，导致膜的流动性降低。

在ER中，RTNs和REEPs不仅生成高曲率的管状结构，还通过形成刚性的支架结构域来增加膜的刚性。这种刚性通过RTN介导的稳定作用，防止管状结构的塌陷。特别是，RTN4a通过形成稳定的晶格结构，加强弯曲膜区域并限制过度的波动。

为了研究蛋白质刚性对膜重塑的影响，我们分析了初始平坦膜在接触不同蛋白质弯曲刚性系数（k0）时的行为。图11展示了不同蛋白质弯曲刚性系数下的膜形态变化。随着k0的增加，膜的管状结构形成变得更加显著。例如，在k0=4时，即使在较低的内在曲率下，膜的管状结构也能够形成。然而，随着蛋白质刚性的增加，膜的总吸附蛋白在饱和状态下会减少。这是因为刚性蛋白在不匹配曲率的膜中插入的能成本更高，导致即使在完全管状结构中，吸附量也较低。在高内在曲率的情况下，高刚性会导致膜结构不稳定，最终导致囊泡化。

此外，我们的模拟结果表明，膜形态从片状到管状网络的转变类似于成核和生长过程。需要一个初始的高曲率区域来引发这种转变，随后管状结构会迅速扩展，直到膜完全管状化。这些发现反映了细胞重大事件中的形态转变。例如，在有丝分裂过程中，ER会从片状结构转变为密集的管状网络。这种再组织过程快速且明显，我们的模型能够复制这种转变：一旦达到一定的蛋白质浓度，膜就会完全转变为管状结构。此外，过多的蛋白质或过于强烈促进曲率的蛋白质（如过度寡聚化的蛋白质）可能导致膜结构的碎片化或异常形态。这在我们的模拟结果中得到了验证，其中高内在曲率和高刚性导致网络囊泡化。

我们的研究结果还表明，膜形态从片状到管状网络的转变依赖于三个关键因素：蛋白质的内在曲率、蛋白质浓度以及蛋白质吸附后对膜的刚性影响。这些因素相互作用，使得膜能够在不同条件下进行形态调控。通过构建相图，我们展示了蛋白质刚性如何影响膜形态变化。图13展示了不同内在曲率和蛋白质刚性下的相图，揭示了管状结构形成的临界浓度。随着蛋白质刚性的增加，临界浓度在低内在曲率下显著降低，而在高内在曲率下则有所提高。这种趋势表明，蛋白质的刚性对膜形态调控具有重要作用，特别是在低内在曲率时。

总之，本研究阐明了蛋白质曲率、膜结合和刚性如何共同塑造ER。我们还发现，这些因素并不孤立作用，而是通过微妙的相互作用，既支持又可能破坏膜结构，具体取决于它们的平衡。通过捕捉这些相互作用，我们的模型为理解正常的ER动态以及疾病中的形态变化提供了有用的工具。尽管本研究在某些方面存在局限性，如未考虑外部力或空间约束，以及仅包含单一类别的ER膜蛋白，但观察到的内在曲率、吸附和刚性之间的耦合效应为我们理解调控ER形态的复杂过程提供了更深入的见解。此外，我们的研究结果为理解ER形态在生理和病理条件下的变化提供了新的思路，例如，在神经退行性疾病中，ER形状蛋白的突变会破坏神经元结构。例如，REEP1的突变已知会导致遗传性痉挛性截瘫，这是一种以轴突退行性变化为特征的疾病。相反，在ER应激或营养匮乏的情况下，ER常常通过生成更多的管状结构来扩展。我们的相图提供了指导，帮助细胞如何上调曲率诱导蛋白以调控ER形态。更广泛地说，这项工作强调了细胞如何调控ER形态的复杂性，提出了进一步的问题，例如，如何在空间上调控局部蛋白质密度和膜组成以分离不同的结构，以及形态变化对初始ER膜形状的敏感性。回答这些问题将有助于确定细胞调控其ER形态的能力。未来的研究可以通过扩展我们的模型框架来探索这些问题。