《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Flexibility in acidophilic thioredoxins: Insights from Asp43 substitutions in
E. coli thioredoxin
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硫氧还蛋白（Trxs）的酸性适应机制研究：通过解析EcTrx中Asp43的突变效应，发现Glu43（祖先型）通过氢键增强稳定性，而Gly/Ala43（酸性适应型）通过结构柔性补偿，Asp43的突变影响热稳定性和催化活性。
Oanh Mai Ho|Mohammed Shazaly A. Elhassan|Khang Nguyen|ChangWoo Lee
韩国庆尚南道大邱大学生物医学科学系与生物纳米材料中心，邮编38453
摘要
硫氧还蛋白（Trxs）是一类小型、高度保守的氧化还原酶，其特征是具有一个具有氧化还原活性的CXXC结构基序。尽管已经描述了现代Trxs（如大肠杆菌中的Trx，EcTrx）的结构适应性，但Trxs适应酸性环境的机制仍不清楚。在EcTrx中，Asp43通过与Lys57的水介导的氢键稳定活性位点区域，这与Asp26共同调节Cys32的质子化状态。比较序列分析显示，在嗜酸Trxs的43位点经常发现非极性残基（如Gly和Ala），这表明该位点的结构灵活性可能有助于其适应酸性环境。为了研究该位点的替换如何影响Trx的稳定性和功能，我们生成了EcTrx在43位的突变体（D43G、D43A、D43S、D43N、D43L和D43E）。热位移和氯化胍（GdmCl）诱导的展开实验表明，D43A和D43S显著降低了稳定性，而D43G保持了中等稳定性，这可能是由于其N端结构更为紧密，类似于嗜酸醋酸杆菌（Acetobacter aceti）中的Trx。这三个突变体还表现出更高的构象灵活性，而D43N和D43L通过极性或疏水侧链提供了部分稳定性。相比之下，D43E（模仿祖先的Glu）恢复了氢键并增强了热稳定性，使其结构最为刚性。大多数突变体在DTNB测定中仍保持催化活性，只有D43S的活性约为野生型的50%。总体而言，我们的结果表明Asp43对于维持EcTrx的结构稳定性至关重要，并表明在该位点增强但不过度的灵活性有助于Trx适应酸性环境。
引言
硫氧还蛋白（Trxs）是一类小型（约12 kDa）、进化上高度保守的氧化还原蛋白，存在于所有生命领域[1,2]。它们的特征是具有CXXC活性位点基序，并通常采用典型的Trx折叠结构，由五个β链和四个α螺旋组成[3,4]。Trx还原酶（TrxR）利用NADPH作为电子供体将氧化的Trx-S2还原为其二硫形式[1,5]。在这种还原状态下，Trx能够将电子传递给多种细胞质蛋白，包括核糖核苷酸还原酶和甲硫氨酸亚砜还原酶[6,7]。Trxs对于维持氧化还原平衡至关重要，并参与细胞信号传导、氧化应激反应以及多种酶的调控[8]。
对祖先Trx序列的重建表明，大约四十亿年前进化出的早期Trxs在结构上较为刚性且热稳定性较高[9]。相比之下，现代Trxs通常结构稳定性较低，表现为熔点（Tm）较低，对尿素和GdmCl等变性剂的抵抗力减弱[9,10]。例如，EcTrx的熔点为80.4°C[11]，而最后一种细菌共同祖先（LBCA）的Trx熔点高达113°C[12]。在结构上，EcTrx保留了一个刚性的中央β折叠片层，而α3螺旋和延长的α1–β2环变得更加灵活，α4螺旋则更加刚性——这些变化有助于其适应中性环境[13,14]。此外，对祖先和现代Trx的比较分析显示，Trx与TrxR之间的配对在进化过程中变得更加特异[15]。然而，Trx仍然对多种下游受体具有广泛的亲和性，包括大肠杆菌中的甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）[16]。尽管结构稳定性较高，LBCA的祖先Trx仍具有催化活性[17]。相比之下，EcTrx在NADPH依赖的TrxR–Trx–MsrA和DTNB（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸）还原反应中表现出更高的特异性活性[15]。总体而言，从刚性祖先酶到灵活现代Trx的进化转变降低了结构稳定性，但提高了催化效率和底物选择性。
Trx对酸性环境的适应远不如其热稳定性变化受到关注。来自醋酸杆菌（Acetobacter aceti）的嗜酸同源蛋白AaTrx与EcTrx有59%的序列一致性，整体折叠结构和表面电荷分布相似，但由于Asp2的侧链占据了EcTrx中Asp43的位置（AaTrx中为Gly43），导致N端结构更为紧密[19]。在EcTrx中，活性位点基序中的Cys32（位于α2上）的pKa通过附近的Asp26（β2）和Lys57（β3）调节，这些残基建立了催化所需的局部静电环境[20,21]。Asp43（α2）通过涉及Ser1、Asp2和Lys57的水介导的氢键网络进一步稳定这一氧化还原活性区域，包括与Ser1的主链相互作用（图1A）。在LBCA Trx中，43位的Glu与Lys57形成更强的相互作用，从而提高了其稳定性[10]。序列比较显示，许多嗜酸Trx的43位由Gly或Ala占据，偶尔也由Glu、Asn或Ser占据（图1B和图S3）。
为了研究43位残基如何影响Trx对酸性环境的适应，我们以EcTrx为模型系统。我们生成了D43G、D43A、D43S和D43N突变体来代表这些替换，以及引入了庞大疏水侧链的D43L，以及模仿蓝细菌、Deinococcus和Thermus类群最后共同祖先（LPBCA）Trx中祖先构型的D43E。作为对比，我们还在AaTrx中引入了G43D和G43E突变，以测试重新引入带电残基是否可以恢复水介导的氢键。然后我们研究了这些替换对蛋白质稳定性、灵活性和催化活性的影响。
EcTrx和AaTrx的表达与纯化
C端带有6个His标签的重组EcTrx和AaTrx（每个含有108个氨基酸）在E. coli BL21(DE3)中成功表达为可溶性蛋白质。这些蛋白质通过HisTrap镍亲和层析和Capto Q阴离子交换层析进行纯化。EcTrx和AaTrx在SDS-PAGE上均呈现单一的约13 kDa条带（图S1），与先前的报告一致[11,35]。
EcTrx WT和突变体的热稳定性
热稳定性通过基于SYPRO的热位移分析进行评估。EcTrx WT的熔点（Tm）为
讨论
在地球上炎热、酸性的海洋中进化的祖先Trxs表现出异常高的结构稳定性[10,12]。相比之下，现代Trx（如EcTrx）的热稳定性降低，灵活性增加[9,36]。尽管外部pH值通常低于6，大多数嗜酸细菌仍通过主动的稳态机制维持接近中性的细胞质pH值（表S5），包括反向膜电位、不透质子的膜、F0F1-ATP酶介导的质子泵送等
CRediT作者贡献声明
Oanh Mai Ho：撰写——初稿，实验研究。Mohammed Shazaly A. Elhassan：实验研究。Khang Nguyen：实验研究。ChangWoo Lee：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划（Basic Science Research Program）的支持，该计划由教育部（Ministry of Education）资助（NRF-2018R1D1A3B07048635，资助对象为C.L.）。作者感谢Eunha Hwang（韩国基础科学研究所）协助测量CD光谱。
