来自淀粉液化芽孢杆菌FS6的一种抗真菌多肽及其对由灰葡萄孢菌引起的人参灰霉病的生物防治潜力

《Biological Conservation》：An antifungal polypeptide from Bacillus amyloliquefaciens FS6 and its biocontrol potential against ginseng gray mold caused by Botrytis cinerea

灰霉病是由Botrytis cinerea引起的严重植物病害，威胁人参生产。本研究通过蛋白组学分析从枯草芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FS6中鉴定出抗真菌多肽（AFP），并构建其过表达菌株FS6-BaAfpOE。实验表明，重组BaAFP蛋白及过表达菌株的发酵液可有效抑制灰霉病菌的菌丝生长、分生孢子萌发及菌丝管延伸，保护及治疗效果分别达91.37%和80.69%。BaAFP表现出优异的热稳定性（耐80℃）、pH稳定性（4-9）及抗紫外线能力，显著优于牛血清白蛋白（BSA）。基因过表达使AFP产量提升4.38倍，发酵液抑菌活性增强9.15%。本研究为开发基于枯草芽孢杆菌的环保生物防治剂提供了理论依据和技术支撑。

　　灰霉病是由灰霉菌（*Botrytis cinerea*）引起的全球性植物病害，严重威胁中国东北地区人参种植的经济可持续性。本研究通过比较蛋白质组学分析，从一种名为FS6的*Bacillus amyloliquefaciens*菌株中识别出一种具有生物防治潜力的抗真菌多肽（AFP）。该AFP蛋白在实验室条件下表现出显著的抗真菌活性，包括抑制灰霉菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝管延伸以及破坏细胞壁完整性。更值得注意的是，该AFP在广泛的pH范围内（4-9）表现出卓越的稳定性，能承受2-8小时的紫外线照射，并在高温条件下（40-80°C）仍能保持活性，其稳定性远超参考蛋白牛血清白蛋白（BSA）。此外，通过在培养基中过表达*afp*基因，构建的FS6-*BaAfp*OE菌株的发酵液（FB）展现出更强的抗真菌能力。在温室试验中，RP BaAFP和FS6-*BaAfp*OE菌株的FB均能有效保护分离的人参组织和整个植株，显著降低灰霉菌感染率。这些发现阐明了AFP在*Ba. amyloliquefaciens* FS6生物防治中的功能作用，并突显了其在人参灰霉病可持续管理中的应用潜力。

*Ba. amyloliquefaciens*作为一种GRAS（普遍认为安全）生物防治菌株，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用，并成为多种植物病害管理中抗真菌多肽的重要来源。其在生物防治策略中的价值在于其能够生产多种AFP，且这些AFP的活性已通过研究得到验证，同时具有监管批准的历史。因此，*Ba. amyloliquefaciens*在开发基于生物的抗真菌策略方面显得尤为重要。

人参作为一种重要的药用植物，主要种植于吉林、黑龙江和辽宁三省，这三省的产量占全球人参总产量的70%以上。然而，人参在长期生长过程中易受多种真菌病原体的侵害，包括引起腐烂病的*Rhizoctonia solani*、引起菌核病的*Sclerotinia sclerotiorum*、引起叶和茎斑病的*Alternaria panax*以及导致灰霉病的*Bo. cinerea*。灰霉病是人参最严重的真菌病害之一，能感染并损伤所有植物部分，包括叶片、叶柄、花、果实和根部。最终会导致茎叶萎蔫和坏死，并严重损害根部。目前，合成化学杀菌剂是控制灰霉病的主要手段。然而，长期使用这些化合物会导致杀菌剂耐药性的发展，增加农药残留和环境污染。因此，开发替代方法以控制人参灰霉病成为迫切需求。

本研究首次通过比较蛋白质组学分析，识别出*Ba. amyloliquefaciens* FS6中具有生物防治潜力的AFP。该AFP蛋白在*Escherichia coli*中表达，并在体外实验中表现出显著的抗真菌活性。在温室试验中，RP BaAFP和FS6-*BaAfp*OE菌株的细胞外发酵液均能有效保护人参组织，显著减少灰霉菌感染。这些结果不仅验证了AFP在*Ba. amyloliquefaciens* FS6生物防治中的关键作用，也为开发基于AFP的生物防治策略提供了理论依据。

在实验方法方面，研究人员首先对*Ba. amyloliquefaciens* FS6进行了培养，并在不同发酵时间点收集发酵液进行蛋白质组学分析。通过TMT（Tandem Mass Tag）定量蛋白质组学技术，鉴定出在不同时间点中显著变化的蛋白质。这些蛋白质被进一步进行功能注释和途径富集分析，从而筛选出具有抗真菌活性的AFP。AFP的结构分析表明，它具有较高的等电点（pI），表明其可能通过静电作用与真菌的负电荷细胞膜相互作用，从而发挥抗真菌作用。此外，AFP在不同环境条件下的稳定性也得到了评估，结果显示其在广泛pH范围、温度变化和紫外线照射下均能保持活性，这使其在实际应用中具有显著优势。

进一步研究发现，*Ba. amyloliquefaciens* FS6中AFP的表达受多种环境因素影响。通过构建过表达菌株FS6-*BaAfp*OE，研究人员显著提高了AFP的产量，从而增强了其抗真菌能力。在温室试验中，该菌株的发酵液表现出更强的生物防治效果，显著降低了灰霉病的发病率和严重程度。这表明，通过分子生物学手段对微生物进行定向改造，可以有效提升其抗病能力，从而缩短生物农药的研发周期。

在AFP的作用机制方面，研究结合了扫描电子显微镜（SEM）和荧光染色技术，观察到灰霉菌菌丝在AFP处理后出现明显的收缩、膜皱缩和细胞质泄漏现象。这表明AFP可能通过破坏真菌细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄和渗透失衡，从而影响菌丝的正常生长。此外，荧光染色实验还揭示了AFP对真菌细胞壁的直接影响，表明其可能通过干扰细胞壁的结构完整性，削弱细胞壁的机械支撑功能。这些发现不仅解释了AFP的抗真菌作用机制，也为未来研究其与其他真菌病原体的相互作用提供了方向。

尽管本研究在实验室条件下验证了AFP的抗真菌活性和稳定性，但仍存在一些局限性。例如，目前尚未有直接的分子相互作用证据，如膜蛋白结合实验或几丁质合成酶活性检测。此外，SEM和荧光染色只能反映处理后的最终状态，无法捕捉AFP与真菌之间的动态相互作用过程，如结合时间、浓度依赖性和早期膜电位变化。因此，未来的研究需要进一步探讨AFP对真菌关键细胞生理指标（如活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位、核酸完整性）的影响，以及其是否通过其他靶点（如氧化应激诱导或DNA损伤）增强抗真菌效果。

本研究还比较了RP BaAFP与BSA的稳定性，结果显示RP BaAFP在广泛的pH范围内、高温和紫外线照射下均表现出更高的稳定性。这种稳定性使其在实际应用中更具优势，尤其是在酸性土壤环境中，而BSA则容易发生变性和聚集。同时，该研究还评估了RP BaAFP和FS6-*BaAfp*OE发酵液在人参根和叶上的保护和治疗效果，发现两者均能有效抑制灰霉菌的感染，且FS6-*BaAfp*OE发酵液表现出更强的防治效果。

综上所述，本研究通过系统的实验设计和先进的技术手段，揭示了AFP在*Ba. amyloliquefaciens* FS6生物防治中的重要作用。这些发现不仅为开发基于AFP的生物防治策略提供了理论基础，也为未来在人参灰霉病防控中的应用提供了参考。下一步的研究应集中在对FS6-*BaAfp*OE菌株的田间验证，明确其与其他真菌代谢产物的协同作用，并探索有效的递送策略。此外，还需进行全面的生物安全性评估，以确保该菌株在环境中的稳定性和潜在的基因转移风险。研究*BaAfp*OE菌株在人参组织中的定殖动态，也有助于理解其长期生物防治效果和在田间环境中的协同作用。