《Biomaterials Advances》：Bioactive cardiac ECM hydrogel sequentially released VEGF and Ang-1 mimic peptides to promote the recovery of myocardial infarction
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心肌梗死治疗中，基于VEGF的血管新生疗法受限于局部浓度不足。本研究构建MMP-2响应性心脏ECM水凝胶，实现VEGF与Ang-1模拟肽（AMP）的时序释放：初期VEGF促进血管生成，后期响应MMP-2升高的环境释放AMP以增强血管成熟，在心肌梗死大鼠模型中显著改善心脏功能。
宋思琪|杨璐|苏凯燕|吴国亮|李宁|王俊凯|于中祥|史春英
青岛市中医院心脏中心，青岛大学附属医院青岛希赛尔医院，中国青岛266071
摘要
基于血管内皮生长因子（VEGF）的治疗性血管生成为心肌梗死（MI）提供了有希望的治疗方法。作为关键的协调因子，血管生成素-1（Ang-1）及其模拟肽（AMP）被证明可以促进VEGF介导的血管重塑和成熟。在本研究中，构建了一种生物活性的心脏细胞外基质（ECM）水凝胶，该水凝胶能够在缺血微环境中响应上调的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）而依次释放VEGF和AMP。这种靶向递送系统能够显著促进功能性血管的形成，减少心肌细胞凋亡，并最终改善心肌梗死大鼠的心脏功能恢复。因此，VEGF和AMP的时空顺序释放系统对于血管再生和组织保护非常有效，为心肌梗死的靶向治疗提供了有力的策略。
引言
心肌梗死（MI）仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一，这是由于梗死区域的心肌细胞不可逆丧失和血液供应受损所致[1]。最近的研究强调了通过编码网络信号来逐步调控MI治疗的微环境调节水凝胶；例如，小分子交联剂可以在MI修复过程中依次进行抗氧化、抗纤维化，然后促进血管生成[2]。与此同时，受生物启发的导电结构-颜色水凝胶作为治疗性心脏贴片出现，它们可以与梗死的心肌电耦合，同时实现视觉监测，从而减轻重塑并促进血管再生[3]。
治疗性血管生成通过重建血液循环和保护心肌细胞为MI提供了有希望的治疗方法[4]。在各种动物模型的研究中，血管内皮生长因子（VEGF）是最有效的血管生成因子，并已被证明可以改善血管生成和心脏功能[5]。尽管在临床前研究中显示出有效性，但VEGF在随机对照试验中对MI患者的疗效有限，主要是因为其从注射部位迅速扩散，导致在心脏动态跳动过程中局部浓度降低[6]。为了保持VEGF的局部浓度，我们之前构建了一种能够特异性结合外源性胶原支架或内源性富含胶原的心脏细胞外基质的VEGF[7,8]。CBD-VEGF是一种融合了胶原结合结构域（CBD）的蛋白质构建体。该构建体旨在利用CBD对胶原/ECM的亲和力来提高VEGF的局部保留和靶向递送，从而增强心肌内的局部血管生成。在大鼠或兔子的MI模型中，CBD-VEGF在注射后1个月显著促进了血管生成和心脏功能恢复。在对猪MI模型的长期随访观察中，CBD-VEGF靶向心脏胶原基质可靠地诱导了更多新形成的血管，这些血管在注射初期不稳定且直径较小[9]。然而，在CBD-VEGF注射12个月后，梗死区域再生的血管数量减少，但血管直径和壁厚度显著增加，这些功能性血管直接关系到心脏功能的改善。因此，提高VEGF诱导的新血管的稳定性将是缺血性疾病治疗中VEGF血管生成的另一种替代策略。
血管生成素-1（Ang-1）是VEGF的关键协调因子[10]。在VEGF诱导的新血管形成后，Ang-1招募血管周细胞并恢复内皮细胞屏障，主要参与血管重塑和成熟为功能性血管[11,12]。在MI治疗中，VEGF和Ang-1的联合递送可以增加功能性血管的形成，促进心肌细胞存活，并最终改善心脏功能[13,14]。然而，在MI后1天，梗死区和梗死周围区域Ang-1的mRNA和蛋白质表达量降低，而在MI后7天，即新血管形成开始时，Ang-1的表达部分恢复[15]。此外，还提出VEGF和Ang-1的下游信号通路相似，这两种因子的联合递送可能会竞争性地激活下游通路[11]。因此，VEGF和Ang-1的顺序释放更符合病理和再生环境中的分子变化，这使其在MI治疗中的联合递送更具吸引力。
为了克服Ang-1的局限性，开发了一种特定的Ang-1模拟肽（AMP）-QHREDGS，它来源于Ang-1的功能域。在先前的研究中，AMP被证明可以增强内皮细胞的存活、管状形成和内皮细胞屏障的功能，这与Ang-1相似[16]，并且将AMP与壳聚糖结合后，心肌细胞（CM）的形态、活力和代谢活性得到改善[17]。在动物模型中，AMP修饰的壳聚糖-胶原水凝胶在MI后显著促进了心脏的功能和形态恢复[18]。这些结果表明，AMP可以模拟Ang-1的生物活性功能，这对MI的治疗有益。
为了实现本研究中AMP的顺序释放，将基质金属蛋白酶-2（MMP-2）切割肽（TIMP肽）与AMP组装，并与心脏细胞外基质（c-ECM）水凝胶结合，构建了响应刺激的CBD-VEGF/c-ECM-TIMP-AMP水凝胶。这些智能响应刺激的水凝胶可以通过CBD-VEGF促进初始血管生成，然后响应缺血心脏中上调的MMP-2释放AMP，从而促进血管成熟为功能性血管，最终改善MI的修复。因此，评估了CBD-VEGF/c-ECM-TIMP-AMP水凝胶在体外和体内对功能性血管再生和心脏功能恢复的影响。
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠（200–220克）购自济南鹏越实验动物繁殖有限公司，实验动物质量许可证：SCXK (LU) 2014-0007。实验前，大鼠被饲养在特定的无病原体设施中，温度为23–25°C，相对湿度为40–60%，光照时间为12小时/黑暗时间12小时，可以自由饮水和进食。在塑形前，大鼠禁食12小时，并可以自由饮水。所有动物实验
AMP和TIMP-AMP肽的体外生物活性
在评估生物活性之前，我们确认肽的加入没有破坏c-ECM水凝胶的整体结构。如图1A所示，宏观照片和电子显微照片显示c-ECM、CBD-VEGF/c-ECM、CBD-VEGF/c-ECM-Ang-1、CBD-VEGF/c-ECM-AMP和CBD-VEGF/c-ECM-TIMP-AMP之间形成了相互连接的多孔网络，没有明显的相分离或塌陷，表明AMP和TIMP-AMP的整合保持了基质框架。
为了验证AMP的生物活性
讨论
目前，通过治疗性血管生成形成功能性血管对于MI修复至关重要，因为它可以恢复血液循环并支持心肌细胞的存活。在本研究中，我们开发了一种功能性c-ECM水凝胶，该水凝胶能够在缺血微环境中响应MMP-2依次释放CBD-VEGF和AMP。我们的结果表明，该系统增强了血管生成，促进了血管成熟，并改善了大鼠MI模型中的心脏功能恢复
CRediT作者贡献声明
宋思琪：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，正式分析。杨璐：正式分析，数据管理。苏凯燕：数据管理，方法学，撰写 – 审稿与编辑。吴国亮：资源管理，项目管理，方法学。李宁：资源管理，正式分析，数据管理。王俊凯：数据管理。于中祥：撰写 – 审稿与编辑，研究设计，概念化。史春英：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，资金获取，数据收集
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢山东省自然科学基金（ZR2023MC168）和青岛市重点医疗卫生学科项目的财政支持。
