细胞机械微环境调节间充质干细胞衍生的外泌体的分泌特性，从而用于糖尿病伤口治疗

《Biomaterials Advances》：Cell mechanical microenvironment modulates the secretion phenotype of mesenchymal stem cell-derived exosomes for diabetic wound therapy

机械微环境调控外泌体功能及糖尿病伤口修复研究。通过构建光交联甲酰化胶原（CMA）和自组装胶原（Col）水凝胶平台，揭示不同力学特性对骨髓间充质干细胞（BMSCs）外泌体（e-Exos和v-Exos）生成及功能的影响。实验表明v-Exos因机械应力松弛特性更优，在PF-127水凝胶负载下显著促进糖尿病大鼠创面肉芽组织形成、上皮化及胶原沉积，抑制TNF-α并增强CD163和CD31表达，同时有效促进血管内皮细胞管状形成及成纤维细胞增殖迁移。

　　本研究聚焦于糖尿病慢性伤口治疗中的一种新兴生物疗法——间质干细胞（MSC）来源的外泌体。外泌体作为一种细胞分泌的纳米级囊泡，因其具有较低的免疫原性、良好的生物相容性以及高效的药物递送能力，被认为是MSC治疗的潜在替代方案。然而，尽管已有大量研究关注外泌体的治疗潜力，大多数研究并未充分考虑细胞微环境对外泌体生成过程的影响，特别是细胞外基质（ECM）中的机械信号如何调控外泌体的生物特性及其在伤口修复中的功能表现。因此，本研究旨在通过构建不同机械特性的细胞微环境，探索其对外泌体生成及功能的影响，从而优化外泌体在糖尿病伤口治疗中的应用效果。

糖尿病慢性伤口的治疗一直是临床医学中的重大挑战，其主要病理特征包括持续的炎症反应、新生血管形成受阻以及ECM重塑异常。这些因素共同导致伤口难以愈合，严重影响患者的生活质量，并给医疗系统带来沉重的经济负担。传统的治疗方法，如先进敷料、生长因子、负压伤口治疗和组织工程移植物，虽然在一定程度上改善了伤口修复效果，但仍存在诸如二次感染、快速降解、靶向性差、免疫排斥等问题，使得整体愈合率仍低于50%。近年来，MSC外泌体因其具备促进血管生成、调节免疫反应、重塑ECM等多重功能，成为糖尿病伤口治疗研究的热点。MSC外泌体能够通过旁分泌机制影响周围细胞的行为，其作用机制涉及多种生物活性成分的传递，如miRNA、蛋白质和脂质等。

然而，目前大多数研究将MSC外泌体直接与生物材料结合，以提高其在伤口部位的滞留和持续释放能力。这种策略虽然在一定程度上提升了外泌体的治疗效果，但忽略了细胞微环境对外泌体生成过程的调控作用。事实上，细胞所处的机械微环境，如ECM的硬度、粘弹性等特性，对外泌体的生成、生物物理特性（如大小、颗粒数量）以及功能负载（如miRNA和蛋白质含量）具有显著影响。因此，如何通过调控细胞微环境来优化外泌体的分泌特征，成为提升MSC外泌体治疗效果的关键。

基于此，本研究构建了两种基于胶原蛋白的水凝胶培养平台，分别模拟弹性与粘弹性细胞微环境。这两种平台在微观结构上表现出相似的纤维形态和弹性模量，但在应力松弛特性上存在显著差异。通过将骨髓间质干细胞（BMSCs）分别培养在这两种水凝胶平台上，我们成功获得了弹性微环境来源的外泌体（e-Exos）和粘弹性微环境来源的外泌体（v-Exos）。比较这两种外泌体的特性后发现，v-Exos相较于e-Exos具有更低的颗粒产量、更大的颗粒尺寸以及更高的蛋白含量。这一差异可能与BMSCs在粘弹性微环境中的基因表达变化有关，例如Rab27a表达上调，而Rab27b、PLD2、SNAP23和CHMP4b等与外泌体生成相关的基因表达下调。

为了验证这两种外泌体在糖尿病伤口修复中的实际效果，我们建立了一个由链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型，并将e-Exos和v-Exos分别负载在温敏性PF-127水凝胶中进行持续递送。实验结果表明，v-Exos在促进糖尿病伤口愈合方面表现出显著优势。与e-Exos相比，v-Exos能够显著加快伤口愈合过程，表现出更强的促组织修复能力。具体而言，v-Exos促进了颗粒组织形成、上皮细胞再生以及胶原蛋白沉积，这些过程是伤口修复的关键环节。此外，v-Exos还能够有效降低伤口部位的促炎因子TNF-α表达水平，同时上调抗炎标志物CD163和血管生成标志物CD31的表达，从而在伤口部位营造一个有利于组织再生的抗炎微环境。

在体外实验中，我们进一步验证了v-Exos在促进血管网络形成和成纤维细胞增殖与迁移方面的优势。与e-Exos相比，v-Exos在促进内皮细胞形成管状结构方面表现出更强的能力，同时显著增强了成纤维细胞的增殖和迁移速度。这些结果表明，v-Exos在血管生成和组织修复方面具有更优越的生物活性，这可能与其在粘弹性微环境中的生成过程有关。

综上所述，本研究通过构建不同机械特性的细胞微环境，成功揭示了细胞机械微环境对外泌体生成和功能的调控作用。我们发现，粘弹性微环境能够显著影响BMSCs的外泌体分泌特征，包括外泌体的颗粒产量、尺寸和蛋白含量。这些变化可能与BMSCs在不同机械微环境中的基因表达模式有关。进一步的体内实验和体外研究均表明，v-Exos在糖尿病伤口修复中表现出更强的治疗效果，这可能与其在调节炎症反应和促进血管生成方面的功能有关。

本研究的意义在于，它为通过调控细胞微环境来优化外泌体的治疗效果提供了新的思路。传统的外泌体制备方法通常依赖于静态培养条件，而本研究通过引入动态机械微环境，使得外泌体的生成过程更加接近生理条件，从而提高了其在体内的生物活性和治疗潜力。此外，我们还发现，粘弹性微环境能够通过影响BMSCs的基因表达，改变外泌体的组成和功能，这为后续研究外泌体的分子机制提供了新的方向。

值得注意的是，尽管我们已经验证了v-Exos在糖尿病伤口修复中的优越性，但其具体的分子机制仍有待进一步探索。例如，Rab27a和Rab27b等蛋白在调控外泌体生成和释放中的作用机制，以及PLD2、SNAP23和CHMP4b等蛋白如何影响外泌体的生物物理特性和功能负载，都是未来研究的重点。此外，我们还需要进一步研究这些外泌体在不同类型的慢性伤口中的应用效果，以评估其在更广泛临床场景中的可行性。

本研究的另一个重要发现是，粘弹性微环境能够通过影响BMSCs的细胞行为，间接改变外泌体的分泌特征。例如，粘弹性水凝胶能够通过调节应力松弛速率，促进成纤维细胞的增殖和迁移，同时诱导MSCs向成骨细胞方向分化。这些细胞行为的变化可能与细胞膜的物理特性、细胞内信号通路的激活以及细胞体积的变化有关。而这些变化又可能进一步影响外泌体的生成和释放过程，从而改变其在体内的功能表现。

此外，我们还发现，粘弹性微环境能够通过激活机械敏感离子通道TRPV4，调节MSCs的细胞体积和行为，进而影响外泌体的生成。TRPV4的激活可能通过影响细胞内的钙离子浓度，进而调控细胞的代谢活动和信号传导通路，最终影响外泌体的分泌。这种机制可能为未来开发具有特定机械特性的生物材料提供了理论依据，使得外泌体的生成过程能够更加精确地调控。

本研究的成果表明，通过调控细胞微环境的机械特性，可以显著优化MSC外泌体的分泌特征和功能表现。这不仅为糖尿病伤口治疗提供了一种新的生物材料策略，也为其他类型的慢性伤口修复提供了潜在的应用价值。同时，这一研究也为外泌体的制备和应用开辟了新的途径，使得外泌体的治疗效果能够通过细胞微环境的调控而得到进一步提升。

在实际应用中，这一策略可能具有重要的临床转化潜力。例如，通过设计具有特定机械特性的水凝胶平台，可以实现对外泌体的精准调控，从而提高其在伤口修复中的治疗效果。此外，这种策略还可以用于其他类型的细胞治疗，如肿瘤治疗、神经退行性疾病治疗等，为相关领域的研究提供新的思路。然而，在推动这一策略进入临床应用之前，还需要进行更多的研究，以确保其安全性和有效性。

从技术角度来看，本研究采用的水凝胶培养平台具有一定的创新性。传统的弹性水凝胶虽然能够模拟ECM的某些物理特性，但在复制ECM的复杂性和动态性方面存在局限。相比之下，粘弹性水凝胶能够更准确地模拟体内ECM的机械行为，从而为细胞提供更接近生理条件的微环境。这种水凝胶的构建方法，不仅为细胞培养提供了新的工具，也为外泌体的制备和功能研究提供了新的平台。

此外，本研究还强调了外泌体在糖尿病伤口修复中的多重作用。除了直接促进血管生成和组织修复外，外泌体还能够通过调节炎症反应，为伤口愈合创造有利的微环境。这种作用机制可能与外泌体中所含的miRNA和蛋白质成分有关。例如，miRNA可以通过调控目标细胞的基因表达，影响其行为和功能；而蛋白质则可以通过直接作用于细胞表面受体，激活或抑制特定的信号通路。因此，外泌体的治疗效果不仅取决于其物理特性，还与其生物活性成分密切相关。

在未来的临床研究中，我们还需要进一步探讨如何优化外泌体的生物活性成分，以提高其治疗效果。例如，通过调控BMSCs的培养条件，可以改变其分泌的外泌体的miRNA和蛋白质组成，从而影响其在体内的功能表现。此外，我们还需要研究外泌体在不同类型的慢性伤口中的应用效果，以评估其在更广泛范围内的治疗潜力。

总的来说，本研究通过构建不同机械特性的细胞微环境，成功揭示了细胞机械微环境对外泌体生成和功能的调控作用。这一发现不仅为糖尿病伤口治疗提供了新的策略，也为其他类型的慢性伤口修复和细胞治疗研究提供了重要的理论支持和技术手段。未来的研究可以进一步探索这些外泌体的分子机制，以及如何通过调控细胞微环境来优化其治疗效果，从而推动这一领域的临床转化和应用。