线粒体内容物的质量决定了源自血管内皮细胞的细胞外囊泡的旁分泌效应

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Mitochondrial cargo quality determines the paracrine effects of extracellular vesicles derived from vascular endothelial cells

内皮细胞（EC）释放的外泌体（EV）中线粒体质量与极化状态影响靶细胞炎症反应。TNF-α激活EC导致释放的EV中线粒体数量增多且极化状态下降，通过添加MitoTEMPO可恢复极化状态并抑制炎症。实验证实线粒体极化状态是EC-EV介导炎症的关键因素，并可能作为心血管疾病（CVD）的生物标志物和治疗靶点。

　　这项研究探讨了内皮细胞（EC）来源的细胞外囊泡（EV）中线粒体负荷的质量如何影响其对目标细胞的旁分泌效应。研究人员发现，当内皮细胞受到肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激时，释放的EV（TNF-EV）不仅数量增加，还携带了更多且处于去极化状态的线粒体，这与未受刺激的内皮细胞释放的EV（C-EV）相比具有显著差异。进一步的实验表明，当使用靶向线粒体的抗氧化剂MitoTEMPO处理受刺激的内皮细胞时，其释放的EV中的线粒体负荷质量得到了恢复，使其与C-EV相似。此外，TNF-EV能够以剂量依赖性方式上调目标内皮细胞的炎症基因表达，而C-EV则没有这种效应。这些结果表明，线粒体的氧化还原状态对EV中线粒体负荷的质量具有决定性作用，而这种质量又在一定程度上决定了EV是否能够引起目标细胞的功能障碍并促进心血管疾病（CVD）的发展。

研究还发现，EV中的线粒体负荷在形态学上呈现出明显的异质性。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）观察，EV的大小分布在100纳米到1微米之间，其中大部分属于大尺寸EV（lEV），而小尺寸EV（sEV）则较少。在lEV中，部分携带线粒体负荷，这些被定义为mitoEV。mitoEV中的线粒体可能处于不同的极化状态，这通过使用不同的荧光探针进行检测，如MitoTracker Green和MitoTracker Red。MitoTracker Green能够标记所有线粒体负荷，无论其是否极化，而MitoTracker Red仅能标记处于极化状态的线粒体。通过这些方法，研究人员能够量化mitoEV的数量及其线粒体负荷的质量。

实验中，通过将受刺激的内皮细胞与目标细胞共同培养，并利用荧光显微镜和流式细胞术，研究人员观察到mitoEV中的线粒体确实能够转移到目标细胞的线粒体网络中，并与之发生共定位。这一发现表明，EV中的线粒体负荷不仅被传递到目标细胞，还能够影响其功能。此外，当C-EV中的线粒体负荷被FCCP（一种质子通透剂）去极化后，这些EV仍然能够引发目标细胞的炎症反应，尽管其能力不如TNF-EV。这说明，线粒体负荷的去极化是触发炎症反应的关键因素之一。

研究还揭示了线粒体负荷的质量对EV的旁分泌效应具有显著影响。在对照条件下，EV中线粒体负荷的极化状态较高，而在TNF-α刺激下，线粒体负荷的极化状态显著下降。这一变化可能与线粒体功能受损有关，从而影响其对目标细胞的信号传递。此外，当使用MitoTEMPO处理受刺激的内皮细胞时，能够恢复其线粒体负荷的极化状态，从而降低EV引发炎症的能力。这表明，通过调控线粒体的氧化还原状态，可以有效改善EV的旁分泌效应，减少其对目标细胞的潜在危害。

在讨论部分，研究人员指出，线粒体来源的EV（mitoEV）能够通过其携带的线粒体损伤相关分子模式（mtDAMP）引发目标细胞的炎症反应。这些mtDAMP包括氧化的线粒体DNA（mtDNA）、线粒体RNA（mtRNA）、活性氧（mROS）、ATP、心磷脂和钙离子等。这些分子在目标细胞的细胞质中激活炎症小体和NF-κB信号通路，从而促进促炎性细胞因子的产生。研究还提到，某些情况下，EV可能同时诱导适应性抗氧化反应，这提示EV的旁分泌效应可能具有双重性。

此外，研究强调了线粒体膜电位（ΔΨ_m）在EV功能中的重要性。ΔΨ_m不仅影响线粒体的呼吸功能，还可能决定了其是否能够引发炎症反应。通过使用MitoTracker Red探针和FCCP处理，研究人员验证了这一观点，即ΔΨ_m的改变会直接影响EV的旁分泌能力。因此，ΔΨ_m可能成为评估内皮细胞功能障碍和心血管疾病发展的一个新生物标志物和治疗靶点。

在方法部分，研究使用了多种技术手段，包括成像流式细胞术、纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜，以全面分析EV的大小、数量、线粒体负荷及其极化状态。成像流式细胞术不仅能够区分携带线粒体负荷的EV（mitoEV）和不携带线粒体的EV（dEV），还能提供关于线粒体负荷质量和数量的详细信息。这些方法的结合使得研究人员能够精确地评估EV的生物学功能，并进一步探讨其在疾病发生发展中的作用。

研究的局限性在于，所有实验均在体外进行，使用的是培养的内皮细胞及其释放的EV。尽管EV已被从患者血液样本中分离出来，并用于研究其对培养细胞的影响，但对mitoEV中线粒体负荷的ΔΨ_m的系统性分析仍然缺乏。因此，未来的研究需要在体内进行验证，以确认这些发现是否适用于活体环境。此外，EV的异质性和缺乏标准化的实验方法也给研究带来了挑战。EV的大小和成分存在显著差异，这可能影响其功能和对目标细胞的作用。

综上所述，这项研究为理解EV在心血管疾病中的作用提供了新的视角。它揭示了线粒体负荷的质量和极化状态如何影响EV的旁分泌效应，并强调了ΔΨ_m在这一过程中的关键作用。这些发现不仅有助于揭示内皮细胞功能障碍的机制，还可能为心血管疾病的早期诊断和治疗提供新的思路。未来的研究可以进一步探索如何通过调控线粒体功能来改善EV的生物学行为，从而开发新的治疗策略。