《Bioorganic Chemistry》：Structural and functional insights into helical antimicrobial peptide–drug conjugates: a dual-action strategy against infection and inflammation
编辑推荐：
抗菌肽与NSAIDs共轭体的抗菌活性、结构特性及抗炎机制研究。通过合成十二种α-螺旋抗菌肽-NSAID共轭体，评估其抗菌效力（MIC值显著降低）、细胞毒性（低毒性）及抗炎活性，发现NPX-C8-LL-I可自组装为纤维，IBF-C8-LK6在无脂环境中保持α螺旋结构并抑制早期促炎细胞因子，而IBF-C10-ATRA-1在负电膜表面显示构象变化。研究证实NSAID共轭策略可调控抗菌肽构象，实现抗菌与抗炎双重功能。
亚历山德拉·瓦莱夫斯卡（Aleksandra Walewska）|安娜·瓦多夫斯卡（Anna Wardowska）|埃米莉亚·伊洛夫斯卡（Emilia I?owska）|马蒂娜·米斯塔尔（Martyna Misztal）|达里乌什·维日科夫斯基（Dariusz Wyrzykowski）|玛尔塔·马科夫斯卡（Marta Makowska）|埃米莉亚·西科尔斯卡（Emilia Sikorska）
格但斯克大学化学系，波兰格但斯克80-308
摘要
抗菌肽（AMPs）由于其破坏细胞膜的作用机制和较低的耐药性倾向，成为传统抗生素的有希望的替代品。我们报告了十二种α-螺旋结构抗菌肽结合物的合成，每种结合物由一种抗菌肽（LL-I、LK6、ATRA-1）通过8-氨基辛酸（C8）或10-氨基癸酸（C10）作为连接剂与布洛芬（IBF）或萘普生（NPX）共价连接而成，这些连接剂的选取基于先前的脂化-活性相关性研究。这些结合物在抗菌效力、细胞毒性和抗炎活性方面进行了评估；其结构特性通过阴离子膜存在下的圆二色性（CD）技术进行了分析。主要候选物（NPX-C8-LL-I、IBF-C8-LK6和IBF-C10-ATRA-1）还接受了血清稳定性、自组装能力和膜相互作用分析。NPX-C8-LL-I表现出由π–π堆积驱动的聚集现象；IBF-C8-LK6在水性缓冲液中保持稳定的α-螺旋构象，并能抑制早期促炎细胞因子的产生；而IBF-C10-ATRA-1则呈现出无序结构，且没有抗炎效果。所有候选结合物在杀菌浓度下均表现出强效的广谱抗菌活性，并且细胞毒性极低。这些结果强调了将非甾体抗炎药（NSAIDs）与抗菌肽结合是一种可调节抗菌肽结构动态并引入双重抗菌-抗炎功能的策略。
引言
在微生物对抗传统抗生素的耐药性日益增加的时代，抗菌肽（AMPs）作为有前景的治疗替代品正受到广泛研究。它们的作用机制主要基于破坏细菌细胞膜，这与传统抗生素有根本不同，因此它们不太容易产生耐药性[1,2]。尽管早期的基于肽的抗生素如革兰氏菌素、多粘菌素和达托霉素已经证明了肽类抗菌剂的临床可行性[3]，但当前的研究已经扩展到包括α-螺旋、β-折叠和环状AMP在内的多种结构类型，这些类型具有广谱活性和额外的免疫调节潜力。几种候选化合物，包括pexiganan、brilacidin和iseganan，已经进入临床试验阶段，这突显了AMPs在对抗耐药性感染方面的转化潜力[4,5]。
非甾体抗炎药（NSAIDs），如布洛芬（IBF）和萘普生（NPX），是用于管理疼痛和炎症的最常用治疗药物之一。它们的主要作用机制是抑制环氧化酶（COX）酶，从而抑制前列腺素的生物合成并减少炎症反应[6]。除了上述特性外，NSAIDs还能通过调节细胞因子产生和免疫细胞功能来调节免疫活性[7,8]。虽然某些NSAIDs也显示出抗菌效果，但这些发现主要针对布洛芬和萘普生，并且通常只在相对较高的浓度下观察到[9],[10],[11],[12],[13]。这种广泛的生物活性，加上它们的结构多样性和药理安全性，使得NSAIDs成为混合药物设计的理想成分。特别是将抗菌肽与布洛芬和萘普生结合，可以增强其抗菌效果，并可能通过提高在生理环境中的稳定性以及调节炎症反应来改善治疗效果。另一个动机是NSAID-肽结合领域仍然相对较少被探索。据我们所知，萘普生和/或布洛芬之前主要与短肽结合，用于形成超分子水凝胶[14,15]，作为药物递送系统或增强镇痛效果[16]。此外，最近的研究报道了布洛芬和萘普生与回文抗癌和抗菌肽RWQWRWQWR的结合物，这些结合物对大肠杆菌（Escherichia coli）表现出抗菌效果[17]。以往关于NSAID-肽结合物的研究主要集中在短链、自组装序列或回文肽上，而没有涉及具有独特结构特征和膜靶向机制的α-螺旋抗菌肽。迄今为止，还没有系统性的研究将抗菌效力、生理条件下的稳定性和免疫调节潜力整合到这一结合物类别中。本研究通过提供对α-螺旋抗菌肽-NSAID结合物的首次全面评估，填补了这一空白，涵盖了其基本的结构和功能特性。
在这项研究中，我们设计并合成了十二种新的α-螺旋抗菌肽与布洛芬或萘普生的结合物，分别是LL-I（VNWKKVLGKIIKVAK-NH2）、LK6（IKKILSKILLKKL-NH2）和ATRA-1（KRFKKFFKKLK-NH2），使用8-氨基辛酸（C8）或10-氨基癸酸（C10）作为连接剂。这项研究延续了我们之前关于脂化及其位置如何影响α-螺旋肽抗菌特性的研究[18,19]。本研究中连接剂长度的选择是基于前述研究的结果。这些结合物在抗菌活性、细胞毒性和抗炎潜力方面进行了评估。通过圆二色性（CD）光谱记录了它们在带负电荷的人工膜存在下的二级结构。此外，还评估了选定结合物（NPX-C8-LL-I、IBF-C8-LK6和IBF-C10-ATRA-1）的血清稳定性、自组装倾向和膜相互作用特性，以深入了解它们的潜在作用机制。基于生物活性测定和构象分析的结果，选择了进行详细研究的类似物。所选结合物在有效抑制微生物生长的浓度下表现出强抗菌活性且无细胞毒性。NPX-C8-LL-I能够自组装成规则纤维。IBF-C8-LK6结合物即使在无脂溶液中也能保持稳定的螺旋结构，并显示出抑制早期促炎细胞因子产生的显著潜力。相比之下，IBF-C10-ATRA-1没有抗炎作用，但在较低浓度下促进了角质形成细胞的增殖；在无脂溶液中，它呈现出无序结构，在带负电荷的人工膜存在下则转变为具有卷曲-卷曲（coiled-coil）结构的螺旋结构。
本研究为设计具有增强抗菌和免疫调节特性的α-螺旋抗菌肽-NSAID结合物提供了新的见解，为开发具有双重治疗功能的下一代抗感染剂提供了一个有前景的平台。
肽的合成与纯化
肽LL-I、LK6和ATRA-1及其结合物是使用Fmoc（芴基-9-甲氧羰基）化学方法在标准条件下手动合成的[20]。合成是在TentaGel S RAM树脂（0.22 mmol/g）上进行的。偶联反应在DMF（N,N-二甲酰胺）中进行，使用的Fmoc-氨基酸/HATU/HOAt/NMM的比例为2.5当量（1:1:1:2），共进行了两次。Fmoc的去保护反应随后完成。
抗菌活性
将这些脂肽与抗炎药物布洛芬（IBF）和萘普生（NPX）结合，显著提高了它们的抗菌活性。与具有相同碳链长度的相应脂肽相比[19]，结合物的MIC值（最低抑菌浓度）显著提高。特别是在对抗大肠杆菌（E. coli）和白色念珠菌（C. albicans）时，MIC值从≥50 μg/mL降低到了3.13–12.5 μg/mL。
CRediT作者贡献声明
亚历山德拉·瓦莱夫斯卡（Aleksandra Walewska）：撰写初稿、数据验证、研究、概念构思。安娜·瓦多夫斯卡（Anna Wardowska）：撰写初稿、研究。埃米莉亚·伊洛夫斯卡（Emilia I?owska）：研究。马蒂娜·米斯塔尔（Martyna Misztal）：研究。达里乌什·维日科夫斯基（Dariusz Wyrzykowski）：研究。玛尔塔·马科夫斯卡（Marta Makowska）：研究。埃米莉亚·西科尔斯卡（Emilia Sikorska）：撰写初稿、数据验证、监督、项目管理、研究、概念构思。
资金来源
本工作得到了青年科学家研究基金（BMN）（编号539-T100-B052-23，格但斯克大学）的支持，以及格但斯克大学研究基金的财政支持（编号531-T100-D744-25）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
