利用混合碳源对受石油污染的海洋土壤中产生生物表面活性剂的细菌进行厌氧富集

《Bioresource Technology Reports》：Anaerobic enrichment of bio-surfactant-producing bacteria from oil-polluted marine soils using mixed carbon sources

本研究从台湾南部沿海石油污染土壤中分离出产生物表面活性剂的光合细菌和硫细菌等微生物群落，通过柴油、葡萄糖及乳酸钠混合物的厌氧富集培养，获得表面张力降低至49.8–55.5 mN/m、临界胶束浓度3.0 g/L的高效生物表面活性剂产生体系，并鉴定出多个新种属。

　　

Bedeny E. Wahby|Chyi-How Lay|Chiu-Yue Lin

台湾台中凤甲大学绿色能源科学技术硕士项目

摘要

生物表面活性剂是一种绿色、环保的分子，能够将碳氢化合物分散成微小的液滴，从而降低表面张力，增加微生物对其的利用效率。本研究分别将柴油、柴油-葡萄糖混合物和柴油-乳酸钠混合物与过滤后的海水混合，用于富集从台湾南部海域采集的受油污染土壤中的细菌群落，以获取能够产生生物表面活性剂的细菌。富集过程在37°C的厌氧条件下进行，所得菌群能够产生具有较低乳化指数（45.7–46.8%）、临界胶束浓度（3.0 g/L）、高生物表面活性剂浓度（6.4–6.6 g/L）以及表面张力（49.8–55.5 mN/m）的生物表面活性剂。这些菌群主要由Marinobacter hydrocarbonoclasticus、Epsilon proteobacterium、Desulfocurvus thunnarius、Agarivorans属、Vibrio tritonius和Neisseria属细菌组成，同时还分离出了一些新型的生物表面活性剂产生菌株。

引言

生物表面活性剂是低分子量化合物，如果其分子量达到2000 KDa，则被称为生物聚合物或生物乳液（Sarubbo等人，2022年）。由于生物表面活性剂在工业领域有多种应用，因此其生产量正在不断增加。2017年全球表面活性剂市场规模为430亿美元，预计到2027年将达到550亿美元（Hausmann和Henkel，2022年）。生物表面活性剂因其源自可再生资源且毒性较低而具有环保优势，因此被广泛应用于食品和化妆品行业（Nagtode等人，2023年）。此外，生物表面活性剂还具有抗菌性能，可用于陆地或海洋环境的油污修复（Naughton等人，2019年）。它们的独特化学结构使其能够降低不同物质相之间的表面和界面张力：这类分子同时含有疏水性和亲水性基团（Drakontis和Amin，2020年）。

从环境来源（尤其是受碳氢化合物污染的场所）筛选能够产生生物表面活性剂的微生物受到了广泛关注，因为它们在多个行业和环境修复领域具有潜在应用价值。生物表面活性剂可通过多种方法利用可持续底物（如食品废弃物或农业废弃物）进行生产（Marcelino等人，2019年）。海洋环境是富集和分离新型生物表面活性剂产生菌株的有利来源（Kubicki等人，2019年）。然而，从海洋环境中分离微生物是一项具有挑战性的任务（Giovannoni等人，2015年）。通常通过添加油性底物的合成培养基来富集这些细菌。例如，Antoniou等人（2015年）使用含有原油的ONR7人工海水培养基成功富集了Roseovarius crassostreae、Thalassospira lucentensis、Shewanella frigidimarina、Alcanivorax borkumensis、Halomonas marina、Marinomonas vaga和Pseudomonas pachastrellaeus等菌株。Zhou等人（2021年）使用添加柴油油的Blood琼脂和低盐培养基分离出了Vibrio属细菌。Hassanshahian（2014年）则使用添加柴油油的Bushnell-Haas和ONR7培养基富集了Shewanella属、Vibrio furnissii、Gallaecimonas pentaromativorans、Brevibacterium epidermidis、Psychrobacter namhaensis和Pseudomonas fluorescens。除了油性底物外，还有研究报道使用添加了色氨酸大豆等碳源的合成培养基分离出了Shewanella属、Bacillus属和Enterobacter属细菌（Curiel-Maciel等人，2021年）。此外，添加酵母提取物的基础海水培养基也能分离出Rhodococcus属细菌（White等人，2013年）。

生物表面活性剂的生产主要通过好氧发酵实现，常用的细菌包括Bacillus subtilis和Pseudomonas aeruginosa（Yue等人，2021年）。然而，研究表明厌氧发酵或限氧发酵条件下的生物表面活性剂产量高于好氧条件（Chen等人，2006年）。此外，厌氧方法还能避免好氧发酵中的泡沫问题（Willenbacher等人，2015年）。还有研究指出，共代谢过程可增强碳氢化合物的降解效率（Singha等人，2025年）。柴油是筛选生物表面活性剂产生菌株的常用底物（Hassanshahian等人，2014年；Zhou等人，2021年；Barzegar等人，2025年）。乳酸钠可促进生物修复过程（Kaksonen和Puhakka，2007年）。葡萄糖具有高度生物降解性，常用于筛选共代谢细菌（Chen和Hyman，2023年）。目前使用的方法大多依赖复杂的碳源，因此开发更简单的筛选方法具有重要意义。

基于以上研究，本研究旨在利用海水与柴油、柴油-葡萄糖混合物及柴油-乳酸钠混合物的组合，在厌氧条件下富集耐受恶劣环境的细菌，并提高其生物表面活性剂的产量。该研究有助于进一步了解台湾受油污染海岸地区的细菌生态。本研究的新颖之处在于提出了一种简单的方法，用于从受油污染的海岸环境中富集生物表面活性剂产生菌群，并分离出一些新型的生物表面活性剂生成菌株。

研究片段

细菌污泥样本和底物

从台湾高雄市的两个受油污染海岸区域——Cijin和Sizihwan收集了两种生物表面活性剂产生细菌污泥。每个污泥样本装入500 mL瓶中，其中海水与受油污染土壤的体积比为1:3。为了富集能够产生生物表面活性剂的细菌，使用了商业柴油作为碳源，制备了三种混合培养基：柴油、柴油-乳酸钠混合物和柴油-葡萄糖混合物。

菌群的微生物生长活性

微生物生长活性是反映细菌富集进程的重要指标。本研究通过测量微生物代谢产物的pH值来评估菌群的生长情况（Ribeiro等人，2021年）。虽然初始培养时的pH值为7.5，但培养后pH值出现了显著变化（介于5到8之间），表明微生物代谢产物发生了变化。其中，使用柴油-葡萄糖混合物富集的菌群表现尤为明显。

结论

本研究表明，使用海水及含有葡萄糖或乳酸钠的柴油混合物作为碳源，可以在厌氧条件下富集出高产生物表面活性剂的细菌，这些生物表面活性剂具有优异的降低表面张力和促进乳液形成的效果。这些碳源的富集效率与已报道的合成培养基相当。实验结果表明，柴油与海水组合成功筛选出了Marinobacter属细菌，该属是降解石油基碳氢化合物的典型菌株。

作者贡献声明

Bedeny E. Wahby：负责撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析及概念框架构建。Chyi-How Lay：负责撰写、审稿与编辑、监督工作、方法设计、实验实施及概念框架构建。Chiu-Yue Lin：负责撰写、审稿与编辑、结果验证、资源协调、实验实施及资金申请。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC 112-2218-E-035-002、NSTC 113-2218-E-035-002和NSTC 114-2218-E-035-003）的支持。