揭示并验证与瘢痕疙瘩中RNA甲基化修饰相关的生物标志物：来自转录组学和孟德尔随机化分析的见解

《Burns》：Uncovering and Validating Biomarkers Associated with RNA Methylation Modifications in Keloids: Insights from Transcriptomic and Mendelian Randomization Analyses

该研究通过加权关联网络分析（WGCNA）和孟德尔随机化筛选出RNA甲基化相关基因PEAR1和MAPKAPK3作为瘢痕疙瘩生物标志物，验证其表达下调，并揭示其通过蛋白酶体、核糖体等通路调控纤维母细胞分化，为精准治疗提供新靶点。

　　### 本文解读

本文研究了瘢痕疙瘩（keloid）这一皮肤疾病，探讨了RNA甲基化在其中的作用。瘢痕疙瘩是一种由异常愈合过程引发的良性纤维增生性疾病，主要表现为皮肤和皮下组织中纤维组织的过度沉积，其病理特征包括异常的细胞增殖和异常的细胞外基质沉积。该病通常表现为生长迅速、伴有疼痛和瘙痒等临床症状，严重影响患者的生活质量。尽管当前临床治疗手段包括手术切除、物理治疗和药物治疗，但这些方法在疗效和复发率方面仍存在不足，因此，寻找有效的分子生物标志物对于改善瘢痕疙瘩的诊断和治疗具有重要意义。

RNA甲基化作为一种可逆的化学修饰过程，涉及腺苷（A）和胞嘧啶（C）上甲基基团的添加或去除。它是生物体中最普遍的RNA修饰之一，已有研究发现超过100种不同的RNA甲基化修饰类型。在多种疾病中，RNA甲基化与疾病发生、发展和治疗反应密切相关。瘢痕疙瘩作为一种良性皮肤肿瘤，其病理变化中也存在显著的表观遗传调控，特别是m6A甲基化修饰，被认为可能通过调控细胞增殖、分化和迁移等过程影响伤口愈合。此外，有研究发现瘢痕疙瘩成纤维细胞表现出活跃的m6A甲基化状态，并可能通过甲基化和激活Wnt/β-catenin通路促进瘢痕疙瘩的发生。因此，RNA甲基化可能成为瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点，但目前关于其与瘢痕疙瘩之间关系的深入研究仍显不足。

为了探索这一领域，本文结合了多种先进的生物信息学技术，包括加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基因表达定量性状位点（eQTL）分析、机器学习模型构建以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）等。通过这些方法，研究者首先筛选出与RNA甲基化相关的基因模块，并将其与差异表达基因（DEGs）进行交叉分析，以识别可能与瘢痕疙瘩发生相关的候选基因。随后，利用孟德尔随机化（MR）分析探讨这些基因与疾病之间的因果关系，并通过机器学习和基因表达验证筛选出潜在的生物标志物。最终，通过单细胞测序技术，研究者详细分析了这些生物标志物在瘢痕疙瘩中的细胞特异性表达和分布模式，并通过RT-qPCR实验进一步验证了其在临床样本中的表达情况。

### 研究方法与流程

本文的研究方法主要分为以下几个步骤：

1. **数据收集**：研究者从公共数据库中获取了与瘢痕疙瘩相关的转录组数据，包括GSE145725、GSE185309和GSE163973三个数据集。其中，GSE145725用于差异表达基因的筛选，GSE185309用于关键基因的表达验证，而GSE163973则主要用于关键细胞簇的识别和细胞间通讯分析。

2. **差异表达基因（DEGs）筛选**：使用“limma”包对GSE145725数据集进行分析，筛选出显著差异表达的基因。设定的筛选标准为|log2 Fold Change| > 0.5和p < 0.05。研究者通过火山图和热图直观展示了这些差异表达基因的分布情况。

3. **加权基因共表达网络分析（WGCNA）**：通过对GSE145725数据集中的基因表达谱进行分析，研究者构建了基因共表达网络。首先通过欧几里得距离进行层次聚类，以识别并去除异常样本。接着，根据无尺度网络的特性，选择了合适的软阈值（R2 = 0.82），并设置了每个模块的最小基因数为200。此外，通过动态树切割算法合并相似模块，以提高候选基因筛选的准确性。

4. **功能富集分析与蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）构建**：使用“clusterProfiler”包对候选基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，以探索这些基因在生物学过程和分子功能中的作用。同时，研究者通过STRING数据库构建了这些基因的蛋白-蛋白相互作用网络，并利用Cytoscape软件进行可视化。

5. **孟德尔随机化（MR）分析**：通过“TwoSampleMR”包对候选基因进行MR分析，以评估其与瘢痕疙瘩之间的因果关系。研究者筛选出与暴露因素显著相关的SNPs，并通过LD修剪确保这些SNPs的独立性。随后，利用多种MR算法（如IVW、加权中位数、MR Egger等）对结果进行分析，并通过散点图、森林图、漏斗图和敏感性分析等方法评估因果关系的可靠性。

6. **机器学习筛选关键基因**：使用LASSO算法和Boruta算法对候选基因进行筛选，以确定其是否与瘢痕疙瘩发生相关。研究者通过交集分析获得了5个关键基因，并进一步验证其在不同数据集中的表达趋势。

7. **构建预测模型**：利用“rms”包对关键基因进行分析，构建了疾病预测模型。通过校准曲线、决策曲线分析（DCA）和ROC曲线评估模型的诊断性能，以确定其是否具有良好的预测效果。

8. **基因集富集分析（GSEA）与免疫浸润分析**：研究者使用GSEA分析进一步探讨关键基因在哪些通路中发挥重要作用，并结合免疫浸润分析评估其在免疫细胞中的表达情况。通过CIBERSORT算法分析了22种免疫细胞在瘢痕疙瘩和正常组织中的分布差异，并通过热图和堆叠图展示了这些细胞的表达模式。

9. **构建生物标志物相关网络**：利用GeneMANIA算法构建了关键基因的相互作用网络，并通过miRDB和ENCORI数据库预测了这些基因的潜在miRNA和lncRNA调控因子。最终，通过Cytoscape软件构建了分子调控网络和关键基因-药物相互作用网络。

10. **单细胞数据的高变异基因筛选**：对GSE163973数据集进行预处理，包括过滤低质量细胞、去除低表达基因和进行标准化处理。研究者筛选出2000个高变异基因，并通过UMAP图展示了细胞分化轨迹和不同细胞类型之间的表达差异。

11. **关键细胞识别**：通过堆叠图和柱状图分析了不同细胞类型在瘢痕疙瘩和正常组织中的比例，并结合GSVA分析进一步探讨了这些细胞在不同通路中的表达情况。最终，研究者确定了成纤维细胞为关键细胞，并通过伪时间分析（pseudotime analysis）评估了关键基因在细胞分化过程中的表达变化。

12. **细胞间通讯分析**：通过CellChat算法分析了不同细胞类型之间的相互作用，特别是在瘢痕疙瘩关键细胞中的受体-配体相互作用。研究者发现成纤维细胞与内皮细胞和角质形成细胞之间存在显著的相互作用，这可能表明成纤维细胞在促进瘢痕疙瘩发生中的重要作用。

13. **RT-qPCR实验验证**：研究者从河北医科大学第二医院收集了瘢痕疙瘩患者和健康对照的组织样本，通过Trizol提取总RNA，并使用SureScript First-strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录。最终，通过RT-qPCR验证了关键基因PEAR1和MAPKAPK3在瘢痕疙瘩组中的表达水平显著低于正常组，这一结果与差异表达分析一致。

### 研究结果与分析

研究结果显示，PEAR1和MAPKAPK3是两个与瘢痕疙瘩发生相关的潜在生物标志物。这些基因主要参与蛋白质降解和核糖体功能等生物学过程，并与髓样树突状细胞和静止的CD4+记忆T细胞相关。进一步的分析表明，这些基因在成纤维细胞中具有显著的表达差异，且在瘢痕疙瘩组织中表达水平显著下降。这一结果与之前的差异表达分析结果一致，表明这些基因可能在瘢痕疙瘩的发病机制中起关键作用。

在功能富集分析中，PEAR1和MAPKAPK3均被富集在与细胞增殖、分化和代谢相关的通路中，包括MAPK信号通路、核糖体功能、蛋白质合成等。这表明这些基因可能通过调控这些通路影响瘢痕疙瘩的发生。此外，免疫浸润分析显示，这些基因与多种免疫细胞的表达相关，特别是在髓样树突状细胞和CD4+记忆T细胞中，其表达水平与这些细胞的浸润程度密切相关。这提示我们，这些基因可能在免疫调控方面也发挥重要作用。

通过构建生物标志物相关网络，研究者进一步探讨了这些基因的调控机制。结果表明，PEAR1和MAPKAPK3可能通过与多种miRNA和lncRNA相互作用，影响细胞的增殖和分化。此外，通过药物预测分析，研究者发现这两个基因可能与多种治疗瘢痕疙瘩的药物相关，包括硅基药物。这为未来的药物研发提供了新的方向。

### 研究意义与展望

本文的研究成果具有重要的临床和科研价值。首先，通过系统的生物信息学分析，研究者识别出了PEAR1和MAPKAPK3作为潜在的生物标志物，这为瘢痕疙瘩的早期诊断和干预提供了新的依据。其次，研究揭示了这些生物标志物在瘢痕疙瘩发生中的作用机制，包括其在细胞增殖、分化和免疫调控中的功能。这有助于深入理解瘢痕疙瘩的分子机制，并为开发新的治疗策略提供理论支持。

此外，本文还通过单细胞测序技术，揭示了成纤维细胞在瘢痕疙瘩中的关键作用。成纤维细胞不仅在瘢痕疙瘩的形成中发挥核心作用，还可能通过调控其他细胞类型（如内皮细胞和角质形成细胞）影响瘢痕疙瘩的发展。因此，成纤维细胞可能成为未来研究瘢痕疙瘩治疗的重要靶点。

最后，研究者通过RT-qPCR实验验证了这些生物标志物在临床样本中的表达情况，进一步确认了其在瘢痕疙瘩中的潜在价值。然而，本文也指出了研究的局限性，包括依赖于现有数据库、样本量有限以及缺乏与临床疤痕严重程度相关的数据。因此，未来的研究需要进一步扩大样本量，结合更全面的临床数据，以及通过动物模型和免疫组化等实验方法进行功能验证。

综上所述，本文通过整合多种先进的生物信息学技术和实验验证，系统地探索了RNA甲基化在瘢痕疙瘩发生中的作用，识别出了两个关键的生物标志物，并揭示了其在细胞增殖、分化和免疫调控中的潜在机制。这些发现不仅为瘢痕疙瘩的诊断和治疗提供了新的思路，也为个性化医疗和精准医学的发展奠定了基础。