M2巨噬细胞衍生的迁移小体通过调控CXCL12/CXCR4信号通路以及中性粒细胞-MMP-9/MSC-EphB2信号通路，共同促进骨折愈合过程

《Cell Biomaterials》：M2 macrophage-derived migrasomes orchestrate dual CXCL12/CXCR4 and neutrophil-MMP-9/MSC-EphB2 signaling to enhance fracture healing

迁移体与外泌体在骨折愈合中的调控机制及新型递送系统研究。通过比较M2型巨噬细胞来源的迁移体（M2-migra）和外泌体（M2-exo）对间充质干细胞（MSC）的招募及骨修复作用，发现M2-migra通过CXCL12/CXCR4信号轴增强MSC迁移，并调控中性粒细胞MMP-9与MSC EphB2相互作用促进成骨分化。结合PLGA纳米颗粒包裹的BMP-2构建的迁移体水凝胶系统，显著提升骨折端MSC富集及骨再生效率。

　　在这项研究中，科学家们关注的是如何通过细胞间的信号传递机制促进骨折愈合。特别是，他们探讨了巨噬细胞衍生的迁移体（migrasomes）与外泌体（exosomes）在引导骨髓间充质干细胞（MSCs）迁移方面的作用差异。这一研究对于开发更有效的组织工程策略具有重要意义，因为它揭示了新的机制，可以用于定向再生医学。

### 巨噬细胞与骨折愈合

骨折修复依赖于从循环系统或周围损伤区域招募具有修复潜力的细胞。MSCs 能够在骨折愈合过程中分化为成骨细胞，并且是组织工程骨构建的理想细胞来源。然而，由于 MSCs 表面受体缺乏，导致其在骨缺损部位的归巢效率较低。因此，提高骨修复过程中局部 MSCs 的数量已成为组织工程骨领域的重要挑战。巨噬细胞及其与 MSCs 的相互作用被认为是骨修复中的关键因素，它们协调炎症反应和组织再生过程。已有研究表明，巨噬细胞影响 MSCs 的分化、迁移和归巢功能。值得注意的是，巨噬细胞和 MSCs 共享一个微环境，其中包括调控骨修复的细胞因子、趋化因子、转录因子和信号分子。这表明巨噬细胞与 MSCs 之间存在信号传递。然而，目前对这种信号传递机制的理解仍不充分。

### 迁移体的发现及其在骨折愈合中的作用

迁移体是一种新型的膜结合细胞器，类似于外泌体，能够介导细胞间通讯。迁移体的直径约为 1–3 微米，包含多个小囊泡，并通过收缩纤维与母细胞连接。通过质谱分析发现，迁移体与外泌体仅共享约 27% 的蛋白质，这表明它们在形态和组成上存在差异。由于免疫细胞具有持续迁移的特性，它们被认为是体内迁移体的主要生产者。最近的研究发现，迁移体也可以由巨噬细胞产生。考虑到巨噬细胞对 MSCs 归巢和成骨分化的影响，研究人员假设巨噬细胞来源的迁移体可能通过调节巨噬细胞与骨 MSCs 的相互作用参与骨折修复。

### 巨噬细胞迁移体与外泌体的比较

为了比较巨噬细胞迁移体与外泌体在促进 MSCs 归巢方面的作用，研究人员提取了来自 M1 和 M2 巨噬细胞的迁移体和外泌体，并在体外与 MSCs 共培养，以观察它们对 MSCs 迁移的影响。通过 Western Blot（WB）检测发现，迁移体中 Tspan4、CPQ 和 PIGK 的表达水平较高，而 Alix 的表达水平较低，这与迁移体的特征一致。而外泌体中 CD63、TSG101 和 Alix 的表达水平则符合外泌体的鉴定标准。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定颗粒大小，发现迁移体的中位直径为 139.8 纳米，平均直径为 153.7 纳米，且大部分颗粒位于 50–150 纳米的小囊泡/外泌体范围内，说明迁移体和外泌体在体外的特性。

在体外实验中，研究人员发现 M2 迁移体比 M2 外泌体更能促进 MSCs 的迁移能力。这一结果通过细胞划痕实验和 Transwell 实验得到验证。通过免疫荧光染色，研究人员发现 M2 迁移体中含有丰富的 CXCL12，而 M2 外泌体则缺乏 CXCL12。CXCL12 是一种重要的趋化因子，能够通过激活 CXCR4 受体促进 MSCs 的归巢。研究人员进一步使用 CXCR4 抑制剂 AMD3100 来阻断 CXCR4 表达，发现其显著抑制了 MSCs 的迁移能力，这表明 CXCL12/CXCR4 轴在 M2 迁移体促进 MSCs 归巢中的作用具有特异性。

### 巨噬细胞迁移体对 MSCs 归巢的促进作用

为了进一步研究迁移体如何促进 MSCs 归巢，研究人员构建了一种迁移体-水凝胶递送系统，并将其注射到小鼠骨折部位。通过活体成像，研究人员发现 M2 迁移体显著增强了 MSCs 向胫骨骨折部位的定向归巢能力。此外，M2 迁移体在骨折修复过程中表现出更快的骨痂形成和更快的骨折端连接，这更有助于骨折愈合。通过免疫荧光染色，研究人员检测了 CD29、BMP-2 和 RUNX2 在骨折愈合组织中的表达情况，发现 M2 迁移体处理组的表达水平显著高于 M2 外泌体处理组，这表明 M2 迁移体不仅能够更有效地招募 MSCs，还能促进其成骨分化。

### 迁移体调节中性粒细胞与 MSCs 的相互作用

研究人员进一步探索了迁移体如何调节中性粒细胞和 MSCs 之间的相互作用。通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和微阵列分析，研究人员发现 M2 迁移体能够增强中性粒细胞来源的 MMP-9 与 MSCs 表达的 EphB2 之间的相互作用。MMP-9 是一种锌依赖性金属蛋白酶，能够降解细胞外基质，并通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路抑制 MSCs 的成骨分化。而 EphB2 是一种受体酪氨酸激酶，能够通过 EphB2/c-Src 信号和 Nrf2 依赖的 Sirt3 表达增强 MSCs 介导的组织再生。研究人员发现，M2 迁移体能够抑制中性粒细胞中 MMP-9 的表达，从而促进 MSCs 中 EphB2 的表达。这一发现表明，M2 迁移体通过调控中性粒细胞 MMP-9 与 MSCs EphB2 的相互作用，增强 MSCs 的成骨分化能力。

### BMP-2 与迁移体的协同作用

为了进一步提高骨折修复效果，研究人员结合了 BMP-2 和 M2 迁移体，构建了一种可注射的迁移体-水凝胶系统。BMP-2 是一种强效的成骨诱导因子，已被 FDA 批准用于脊柱融合和某些胫骨骨折的治疗。通过使用流体实验室的双乳液滴微流控平台，研究人员将 BMP-2 溶解在含有 Cy5.5 标记的 BSA（BSA-Cy5.5）、蔗糖的水溶液中，并通过 W1/O/W2 双乳液溶剂蒸发法将 BMP-2 封装在 PLGA 纳米颗粒中。通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）检测，研究人员发现 PLGA 封装的 BMP-2 具有均匀的大小和光滑的表面，且主要分布在 78.8–295.5 纳米范围内，平均直径为 186.6 纳米。这种 PLGA 封装的 BMP-2 被封装在迁移体-水凝胶系统中，并通过活体成像观察其在骨折部位的释放情况。研究人员发现，迁移体-水凝胶系统能够实现迁移体和 BMP-2 的持续释放，从而逐步招募 MSCs 并促进其成骨分化。

### 迁移体-水凝胶系统的安全性与有效性

为了评估迁移体-水凝胶系统的安全性，研究人员对小鼠的多个器官进行了组织学染色（H&E 染色），发现迁移体-水凝胶注射后，小鼠的心脏、大脑、肝脏、肾脏和肺部未出现明显的损伤，表明该系统在组织工程中的应用是安全的。此外，通过微计算机断层扫描（micro-CT）分析，研究人员发现 M2 迁移体-水凝胶系统在骨折愈合过程中表现出更优的效果，特别是在第 3、5 和 7 天的骨痂形成和骨体积变化方面。

### 巨噬细胞迁移体与外泌体的异同

虽然迁移体和外泌体都是细胞间通讯的介质，但它们在形态、组成和功能上存在显著差异。迁移体具有较大的直径（1–3 微米），并且含有丰富的 CXCL12，而外泌体的直径较小（30–150 纳米），且其 CXCL12 表达水平较低。此外，迁移体在体外和体内均表现出更强的 MSCs 归巢能力，这可能与其丰富的 CXCL12 有关。而外泌体虽然也能够促进 MSCs 的迁移，但其效果不如迁移体显著。这表明，迁移体在骨折修复中的作用可能比外泌体更为重要。

### 研究方法与实验设计

研究人员采用了一系列实验方法来验证他们的假设。其中包括单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、微阵列分析、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、共聚焦显微镜、WB 检测、细胞划痕实验和 Transwell 实验。此外，他们还构建了一种可注射的迁移体-水凝胶系统，并使用 Cy5.5 标记的 BSA 和 DIR 标记的 MSCs 进行活体成像。通过这些实验，研究人员能够观察到迁移体和外泌体在体内对 MSCs 归巢和骨折愈合的影响。

### 研究的意义与未来方向

这项研究首次揭示了 M2 迁移体在骨折修复中的作用，并表明其在促进 MSCs 归巢和成骨分化方面优于 M2 外泌体。此外，迁移体-水凝胶系统能够实现生物活性因子的持续释放，从而显著提高 MSCs 的归巢效率和骨再生能力。这些发现不仅有助于理解巨噬细胞囊泡在骨折修复中的不同作用，也为更精确的组织工程策略提供了新的思路。未来，研究人员计划进一步探索迁移体的生物合成和其负载的生物活性因子在骨折修复中的具体作用机制，并通过宏基因组学和宏基因组学分析来揭示其在组织工程中的潜在应用价值。