连接蛋白43作为人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞核膜中的新型钙离子（Ca2+）转运途径

《Cell Calcium》：Connexin 43 as a novel Ca2+ transport pathway in the nuclear envelope of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes

核膜钙信号动态及Cx43调控机制研究。使用GCaMP6s-LaminB1探针发现核膜钙信号在自发搏动和咖啡因刺激下呈现延迟上升和持久衰减特征，且不依赖SR钙释放（CICR）。突变 RyR2（E3848A/Q3925E）仍维持自发搏动和核膜钙信号，抑制Cx43可阻断咖啡因诱导的核膜钙摄取，提示Cx43介导核膜钙运输。该研究揭示了心脏细胞核膜钙信号的非SR依赖性调控通路。

　　### 心脏细胞核膜钙信号的探索与发现

心脏细胞中的钙信号在调控心肌收缩和细胞功能方面起着至关重要的作用。钙信号不仅通过细胞质和肌浆网（SR）实现，还涉及细胞核膜（NE）的动态变化。尽管细胞质和SR的钙信号机制已经被广泛研究，但NE在钙动态中的作用以及其钙转运蛋白的识别和调控机制仍处于初步探索阶段。本研究通过构建一种靶向核层蛋白LaminB1的钙探针，首次直接测量了NE的钙信号，并揭示了其在心脏功能中的重要性。

### NE的结构与功能

细胞核膜是双层脂质膜结构，它将细胞核与细胞质分隔开。核膜由内核膜（INM）和外核膜（ONM）组成，两者具有不同的膜蛋白组成和功能。INM主要包含LAP1、LAP2β、SUN、LBR等蛋白质，这些蛋白在维持核结构、调控基因表达和DNA复制中起关键作用。而ONM则富含Nesprins蛋白，这些蛋白与细胞骨架相连，为细胞核提供机械支持。核层（nuclear lamina）位于INM下方，是由A型和B型层蛋白构成的密集网络，它不仅维持细胞核的结构稳定性，还参与基因调控和细胞信号传导。

### NE钙信号的初步研究

已有研究表明，NE可能作为钙储存和释放的场所。例如，在某些实验中，使用20 mM的咖啡因可以可逆地抑制NE中的Mag-Fluo-4荧光信号，这表明NE能够作为钙储存库，参与钙信号的调节。然而，这一发现引发了新的问题，因为咖啡因通常被认为是通过激活SR上的RyR2通道释放钙离子的。一些研究曾提出，RyR2可能存在于NE中，但后来的研究未能证实这一点。尽管如此，免疫染色结果显示，NE中存在核孔复合体（NPC）和SERCA2a等钙转运蛋白，这表明钙可能通过NPC转运进入NE腔内，并由SERCA2a进行再摄取。

### 实验方法与探针设计

为了更精确地研究NE的钙信号，本研究构建了一种新型的荧光探针——GCaMP6s-LaminB1。该探针通过基因工程手段，将GCaMP6s钙感应蛋白靶向到LaminB1上，从而实现对核层钙动态的监测。通过这一探针，研究人员能够在hiPSC-CMs中观察到核层钙信号的变化，并发现其在激活过程中表现出显著的延迟和缓慢的上升趋势。此外，使用高分辨率共聚焦显微镜，研究人员能够确认该探针在核层的特异性定位，而不会影响其他细胞区域的钙信号。

### NE钙信号的特性与动态变化

在实验中，研究人员发现，hiPSC-CMs在自发搏动过程中，核层钙信号表现出比细胞质钙信号更显著的波动。同时，使用咖啡因可以进一步增强核层钙信号的幅度，表明咖啡因可能通过某种机制促进NE的钙释放。然而，当使用CICR功能受损的RyR2突变体（如E3848A和Q3925E）进行实验时，核层钙信号显著减弱，这表明SR钙释放对NE钙水平的维持至关重要。尽管如此，这些突变体细胞仍然能够保持自发搏动，这提示可能存在替代的钙转运机制，如通过Cx43介导的钙通道。

### Cx43在NE中的表达与功能

Connexin43（Cx43）是心肌细胞中主要的间隙连接蛋白，传统上被认为主要参与细胞间的电信号传导和代谢物质交换。然而，越来越多的证据表明，Cx43可能在细胞核内也具有重要的功能。通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像，研究人员在hiPSC-CMs的NE中检测到了Cx43的表达。这提示Cx43可能在NE中形成功能性半通道，参与钙的运输。此外，使用Cx43抑制剂Gap19后，核层钙信号被显著抑制，进一步支持了Cx43在NE钙转运中的作用。

### 研究发现与意义

本研究的结果表明，尽管SR钙释放是维持NE钙水平的重要途径，但在某些情况下，如CICR功能受损时，NE可能通过其他机制，如Cx43介导的钙通道，维持其钙动态。这一发现不仅拓展了我们对心脏钙信号网络的理解，还为研究心脏疾病中的钙失衡机制提供了新的视角。例如，某些心律失常可能与NE钙信号的异常有关，而Cx43的表达和功能可能在其中起到关键作用。

### 未来研究方向

尽管本研究提供了关于NE钙信号的重要信息，但仍存在一些局限性。首先，当前的GCaMP6s-LaminB1探针仅能检测到核层的钙信号，而无法监测NE腔内的钙动态。因此，需要开发新的探针来更全面地研究NE的钙信号。其次，本研究未在RyR2突变体细胞中进行Gap19实验，这可能影响对替代钙转运机制的全面理解。未来的研究可以进一步探索这些方面，以更深入地揭示NE在心脏钙信号中的复杂作用。

### 结论

本研究通过构建靶向LaminB1的钙探针，首次直接测量了NE的钙信号，并揭示了其在心脏功能中的重要性。研究发现，NE不仅作为钙储存的场所，还可能通过不同的机制参与钙的运输和释放。特别是，Cx43在NE中的表达和功能可能为维持自发搏动提供了替代的钙转运途径。这些发现为理解心脏钙信号网络的复杂性以及相关疾病的发病机制提供了新的思路和研究方向。